丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因6的反式激活基因的筛选

目的:筛选与克隆:NS5A反式激活的新型靶基因NS5ATP6 的反式激活基因,探讨其可能存在的调节功能. 方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioin- formatics)技术筛选并克隆NS5ATP6反式激活的新型靶基因.以NS5ATP6表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5ATP6转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经Rsa Ⅰ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接, 构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析. 结果:成功构建人NS5ATP6反式激活基因差异表达的cDNA 消减文库.文库扩增后得到33个阳性克隆,进行菌落PCR 分析,均得到200-2 000 bp插入片段.对插入片段测序, 并通过生物信息学分析获得其全长基因序列,结果共获得26种编码基因,包括24种已知基因和2种未知基因. 结论:筛选到的cDNA全长序列,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了NS5ATP6可能存在的调控机制的线索,尚需进一步的实验证明.

丙型肝炎病毒非结构蛋白HS5A反式激活基因HS5ATP6的克隆化研究

目的 应用抑制性消减杂交 (SSH)技术及生物信息学技术 (bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 .1(-) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 .1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性 ,利用表达序列标签 (EST)序列的搜索和比对 ,进行电子拼接 ,根据基因起始密码子的KOZ2ak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。结果 从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应(RT PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,命名为NS5ATP6,在GenBank中注册 ,注册号为AF5 2 93 67。NS5ATP6基因的编码序列全长为 15 72个核苷酸 (nt) ,编码产物由 5 2 4个氨基酸残基 (aa)组成。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP6的筛选与克隆 。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因的克隆化研究

应用抑制性消减杂交技术构建丙型肝炎病毒非结构蛋白 5A(HCVNS5A)反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,克隆HCVNS5A蛋白反式激活相关基因。以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(- ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(- )为对照 ,制备转染后的细胞裂解液 ,提取mRNA并逆转录为cDNA ,经RsaI酶切后 ,将实验组cDNA分成两组 ,分别与两种不同的接头衔接 ,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR ,将产物与T/A载体连接 ,构建cDNA消减文库 ,并转染大肠杆菌进行文库扩增 ,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。文库扩增后得到 12 1个阳性克隆 ,经菌落PCR分析 ,得到 115个 2 0 0～10 0 0bp的插入片段 ,对其中的 90个片段测序 ,并进行同源性分析 ,显示 31种已知基因编码蛋白和 15种未知功能基因序列 ,包括一些与细胞周期、细胞凋亡、信号传导及肿瘤发生等细胞生长调节密切相关的蛋白编码基因 ,可能是NS5A反式激活靶基因。结果提示 ,成功构建了HCVNS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,该文库的建立为进一步阐明HCVNS5A反式调节的靶基因及致肝细胞癌发生的分子生物学机制提供了理论依据。

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因10的克隆化研究

目的:丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白5A(NS5A)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质.为了探索HCV NS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因,我们应用微矩阵(microarray)技术对于转染和未转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析.研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:根据HCV-H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物.以含有全长HCV-H株cDNA的pBRTM-3011质粒DNA作为模板,进行多聚酶链反应(PCR)扩增,将获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列测定,构建真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A.以pcDNA3.1(-)-NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总RNA,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术(bioinformatics),克隆HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因.结果:构建了真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误.以pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2后提取总RNA,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析.应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因,命名为NS5ATP10,新基因的编码基因序列全长为717个核苷酸(nt),编码产物由238个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV NS5A是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白.微矩阵技术是分析基因表达谱变化的有效和高通量技术.发现了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为阐明HCV NS5A蛋白的反式激活作用及其机制,开辟了新的研究方向.

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因4的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因NS5ATP4的基因序列的确立及基因克隆化研究。方法 依据我室构建的NS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库 ,利用生物信息学技术获得新基因NS5ATP4的编码序列 ,对其可能的氨基酸序列进行分析比较 ,并对其基因利用多聚酶链反应技术 (PCR)进行克隆化研究。结果 发现了HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因NS5ATP4。结论 这一发现 ,为阐明HCVVNS5A蛋白的反式激活作用及其机制 。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP9的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)反式激活新型靶基因 ,研究HCVNS5A反式激活作用的分子生物学机制。方法 应用抑制性消减杂交技术 (SSH)及生物信息学技术 ,以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(-) -NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析。对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性 ,利用表达序列标签 (EST)序列数据库的搜索和比对 ,进行电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录多聚酶链反应 (RT -PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列 ,并测序证实 ,命名为NS5ATP9,在GenBank中注册 ,注册号为AF5 2 93 70。结果 NS5ATP9基因的编码序列全长为 3 3 6个核苷酸 (nt) ,编码产物由 111个氨基酸残基 (aa)组成 ,并成功的克隆化。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP9的筛选与克隆 。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活基因6的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 3 (NS3 )是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质。为了探索HCVNS3病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因 ,我们应用微矩阵 (microarray)技术对于转染和末转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 根据HCV H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV H株cDNA的pBRTM 3 0 11质粒DNA作为模板 ,进行多聚酶链反应 (PCR)扩增 ,获得的HCVNS3编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定 ,构建真核表达载体pcDNA3 .1(-) NS3。以pcDNA3 .1(-) NS3转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取总RNA ,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 (bioinformatics) ,克隆HCVNS3反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3 .1(-) NS3 ,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以pcDNA3 .1(-) NS3转染HepG2后提取总RNA ,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS3反式激活的新型靶基因 ,命名为NS3TP6,新基因的编码基因序列全长为 414个核苷酸 (nt) ,编码产物由 13 8个氨基酸残基 (aa)组成。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因1的克隆

目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制. 方法:以HCV NS5A蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A 转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,分析并克隆HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因. 结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,从转染pcDNA3.1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为NS5ATP1. NS5ATP1基因的编码序列全长为1011个核苷酸(nt),编码产物由336个氨基酸残基(aa)组成. 结论:HCV NS5ATP1是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白,而SSH是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术.通过这种技术,发现了HCV NS5ATP1反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为进一步研究HCV NS5ATP1蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP3的克隆化研究

目的 筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)反式激活新型靶基因。方法 以HCVNS5A表达质粒pcD NA3.1( ) NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3.1( )为平行对照 ,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析 ,应用生物信息学方法对所获基因片段序列进行分析发现 ,其中有新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性。通过序列同源性搜索、比对和电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。从转染了pcD NA3.1( ) NS5A的HepG2细胞提取总RNA ,以逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)技术扩增 ,获得阳性克隆之后 ,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析。结果 该新基因的编码序列全长为 15 72nt,编码产物由 5 2 4aa组成 ,并测序证实 ,命名为NS5ATP3,在GenBank中注册 ,注册号为AF5 2 936 4。结论 分子生物学技术与生物信息学技术相结合 ,发现并鉴定、克隆了HCVNS5A反式激活作用的新型靶基因NS5ATP3。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP5的克隆

目的:应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白5A(HCV NS5A)反式激活新型靶基因.方法:以 HCV NS5A 表达质粒 pcDNA3.1(-)-NS5A 转染HepG2细胞,以空载体 pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA 并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与 GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的 Kozak 规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从 HepG2细胞提取总 RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实.结果:NS5ATP5基因的编码序列全长为1191个核苷酸(nt),编码产物由396个氨基酸残基(aa)组成.命名为NS5ATP5,在 GenBank 中注册,注册号为 AF529366.结论:HCV NS5A 反式激活新型靶基因 NS5ATP5的筛选与克隆,为进一步研究 HCV NS5A 反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因2的克隆化研究

目的:对丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)蛋白反式激活靶基因2(NS5A-TP2)的基因作克隆化研究。方法:依据我室构建的HCVNS5A反式激活基因差异表达的cDNA消减文库筛选结果,利用分子生物学与生物信息学技术相结合的方法获得新基因NS5-ATP2的编码序列,对其氨基酸序列进行分析比较,并对其进行克隆化研究。结果:NS5A-TP2基因编码区为615核苷酸(nt),编码产物为204氨基酸残基(aa)。经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性,说明我们克隆的NS5A-TP2基因属于未知功能新基因。结论:发现了HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为研究新基因的生物学功能及慢性丙型肝炎发病机制提供新的思路。

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因NS5ATP13的克隆化研究

目的 应用微矩阵 (microarray)技术 ,结合生物信息学 (bioinformatics)技术筛选并克隆丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白5A(NS5A)的反式激活基因 ,阐明慢性HCV感染、肝纤维化及肝细胞癌 (HCC)的等相关疾病的发病机制。方法 根据HCV H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV H株cDNA的pBRTM 3 0 11质粒DNA作为模板 ,进行多聚酶链反应 (PCR)扩增 ,获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定 ,构建真核表达载体pcDNA3 1(-) NS5A。以pcD NA3 1(-) NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取总RNA ,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 ,克隆HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcDNA3 1(-) NS5A ,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以pcDNA3 1(-) NS5A转染HepG2后提取总RNA ,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因 ,命名为NS5ATP13 ,在GenBank中登录 ,登录号为D2 12 62。NS5ATP13基因的编码序列全长为 2 10 3个核苷酸 (nt) ,编码产物由 70 0个氨基酸残基 (aa)组成。结论 丙型肝炎病毒NS5A基因产物具有显著的反?

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因11的克隆化研究

目的 为了探索丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白 5A(NS5A)病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因 ,我们应用基因芯片技术对于转染和未转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 根据HCV H病毒株序列设计、合成序列特异性的引物。以含有全长HCV H株cDNA的pBRTN 3 0 11质粒DNA作为模板 ,进行多聚酶链反应 (PCR)扩增 ,获得的HCVNS5A编码基因片段克隆到TA载体中进行核苷酸序列的测定 ,构建真核表达载体pcDNA3 1(-) NS5A。以pcDNA3 .1(-) NS5A转染肝母细胞瘤细胞系HepG2 ,提取总RNA ,逆转录为cDNA后进行表达谱基因芯片分析。应用分子生物学技术 ,结合生物信息学技术 (bioinformatics) ,克隆HCVNS5A反式激活作用的新的靶基因。结果 构建了真核表达载体pcD NA3 1(-) NS5A ,经过限制性内切酶作图分析和核苷酸序列分析证实正确无误。以PCDNA3 1(-) NS5A转染HepG2后提取总RNA ,逆转录后进行表达谱基因芯片技术分析。应用分子克隆技术结合生物信息学技术克隆NS5A反式激活的新型靶基因 ,命名为NS5ATP11,新基因的编码基因序列全长为 12 5 7个核苷酸 (nt) ,编码产物由 418个氨基酸残基 (aa)。结论 HCVNS5A是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白。

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子序列的确定及转录活性的鉴定

目的:阐明丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A(NS5A)反式激活基因NS5A-TP9表达的调控机制。方法:选取NS5A-TP9基因翻译起始密码子ATG上游661 bp的基因组DNA序列作为启动子序列,应用聚合酶链反应(PCR)技术,以肝母细胞瘤细胞系HepG2基因组DNA为模板,扩增该启动子DNA片段,将其克隆至pCAT3中,构建pCAT3-NS5A-TP9-promoter报告基因表达载体,以该质粒转染HepG2细胞,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测报告基因编码产物氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性。结果:发现质粒pCAT3-NS5A-TP9-promoter具有指导报告基因CAT转录表达的启动子活性,CAT的吸光度(A值)是缺乏启动子序列对照质粒pCAT3的13.9倍。结论:本研究克隆的启动子DNA序列具有指导下游基因转录的启动子活性,这一结果为研究新基因NS5A-TP9转录表达的调节机制,进一步阐明丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A的作用机制奠定了基础。

应用噬菌体展示技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA的结合蛋白

目的:筛选丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白,探索NS5A-TP9的表达调节机制。方法:应用噬菌体展示技术,以聚合酶链反应(PCR)技术扩增的NS5A-TP9启动子DNA片段作为固相筛选分子,对噬菌体人肝细胞cDNA文库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”富集过程,噬斑裂解液PCR扩增后,回收产物构建克隆载体,对所筛选克隆进行DNA序列分析和同源性生物信息学搜索。结果:噬菌体经富集后,筛选出10个阳性克隆,成功构建了克隆载体。序列测定后经过同源性搜索,确定了与HCV非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合的蛋白有:补体C3、甲胎蛋白、人血清白蛋白、人核糖体蛋白20S和α1微球蛋白。结论:用噬菌体人肝cDNA文库筛选得到HCV NS5A蛋白反式激活基因NS5A-TP9启动子DNA结合蛋白,分析了这些蛋白的功能,为研究NS5A-TP9基因的转录调节机制,进一步阐明HCV非结构蛋白NS5A的致病机制奠定了基础。

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5反式调节基因的筛选

目的:应用基因表达谱芯片技术研究丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白5的反式调节基因. 方法:以分子生物学技术构建NS5ATP5的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5ATP5,以表达质粒pcDNA3.1(-)- NS5ATP5转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA.应用基因表达谱芯片技术对差异表达mRNA进行检测和分析. 结果:HepG2细胞经转染NS5ATP5后,有17条基因表达增强,12条基因表达降低. 结论:成功筛选了NS5ATP5的反式调节基因,为进一步阐明NS5ATP5的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP7的克隆

目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因. 方法:以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行SSH分析.对于所获基因片段序列分析表明, 其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源陛,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为NS5ATP7,在GenBank中注册,注册号为AF529368. 结果:NS5ATP5基因的编码序列全长为894个核苷酸(nt), 编码产物由297个氨基酸残基(aa)组成. 结论:HCV NS5A反式激活新型靶基因NS5ATP5的筛选与克隆,为进一步研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.

丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活基因8的克隆化研究

目的 丙型肝炎病毒 (HCV)的非结构蛋白 5A(NS5A)是一种具有显著反式激活作用的病毒蛋白质。为了探索HCVNS5A病毒蛋白反式激活作用的新的靶基因 ,我们应用抑制性消减杂交 (SSH)技术对于转染和未转染的肝母细胞瘤细胞系HepG2进行分析。研究结果将有助于阐明HCV感染相关疾病的发病机制。方法 以HCVNS5A表达质粒pcDNA3 1(-)_NS5A转染HepG2细胞 ,以空载体pcDNA3 1(-)为平行对照 ,提取mRNA并进行SSH分析。对于所获基因片段序列分析表明 ,其中之一为新型基因片段 ,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性 ,利用表达序列标签 (EST)序列的搜索和比对 ,进行电子拼接 ,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列 ,确定新型基因序列。结果 结果从HepG2细胞提取总RNA ,多聚酶链反应 (RT_PCR )技术扩增获得该新基因的全长序列 ,测序证实 ,命名为NS5ATP8在GenBank中注册 ,注册号为AF5 2 93 69。NS5ATP8基因的编码序列全长为 14 49(nt) ,编码产物由 483个氨基酸残基 (aa)组成。结论 HCVNS5A反式激活新型靶基因NS5ATP8筛选与克隆 。

应用表达谱芯片技术对丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式调节基因的研究

目的:应用基因表达谱芯片研究丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)的反式调节基因.方法:构建NS5A基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-NS5A,应用基因表达谱芯片技术对pcDNA3.1(-)-NS5A转染的HepG2(人肝母细胞瘤细胞系)细胞和转染空载体的相同细胞的差异表达mRNA进行检测和分析.结果:HepG2细胞经转染NS5A后,有54条差异基因表达,其中28条基因表达增强,26条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞的增生、分化及细胞的信号转导密切相关.结论:应用基因表达谱芯片成功筛选了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的反式调节基因,为进一步阐明丙型肝炎病毒非结构蛋白5A的反式激活作用及免疫调节机制提供了新的依据.

应用抑制性消减杂交技术克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3反式激活的相关基因

目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式激活的相关基因cDNA消减文库,克隆HCV NS3反式激活相关基因。方法:以HCV NS3表达质粒pcDNA3.1(-)-NS3转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为对照;制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR,将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果:文库扩增后得到70个白色克隆,经菌落PCR分析,得到56个200-1000 b插入片段。对所得片段测序,并进行同源性分析,获得6个差异表达的未知序列,可能是NS3反式激活的新的靶基因。结论:成功构建HCV NS3反式激活的相关基因cDNA消减文库,为今后进一步分析、研究病毒蛋白的致病机制奠定基础。