四环素诱导的丙型肝炎病毒非结构蛋白5B稳定细胞株的构建和检测

丙型肝炎病毒(HCV)感染个体后在宿主细胞内长时间保持低水平复制,与慢性肝炎、肝硬化及肝细胞肝癌的发生密切相关。目前,HCV感染后肝细胞发生转化的具体机制还不清楚。非结构蛋白5B(NS5B)是HCV编码的非结构蛋白之一,具有RNA依赖的RNA聚合酶活性(RdRp),是病毒复制所需的关键酶。除参与病毒复制外,NS5B通过直接与宿主蛋白相互作用影响细胞的正常功能逐渐成为人们关注的焦点。为深入了解NS5B在病毒复制和致病过程中的作用,本研究在肝癌细胞系HepG2细胞中构建了可由四环素诱导(Tet-On)的NS5B稳定细胞株。结果显示,与对照组相比,加入四环素可成功诱导NS5B。加入不同浓度的四环素或经过不同的诱导时间,目的蛋白均能同时被标签抗体和抗NS5B抗体检测。免疫荧光法进一步证实NS5B存在于细胞质内。本研究所构建的NS5B稳定细胞株可用于诸多后续试验,为深入研究NS5B的功能提供了细胞模型。

丙型肝炎病毒非结构蛋白5B的研究进展

已知丙型肝炎病毒非结构蛋白(NS5B)具有RNA依赖的RNA聚合酶的功能,负责病毒基因组的复制。通过体外表达及晶体衍射分析,目前对NS5B的三维结构已有了清晰的描述,对NS5B催化该病毒基因组复制的分子机制也有了初步了解;对RNA聚合酶抑制物的研究将为人工设计特异性的抗该病毒药物奠定扎实基础。

丙型肝炎病毒非结构蛋白5B聚合酶抑制剂的研究进展

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染是全球范围内的健康挑战。该病毒的非结构蛋白5B(non-structural protein 5B,NS5B)聚合酶对其RNA的复制起到了关键作用,是抗HCV药物研究的关键靶标。近年来,针对HCV NS5B聚合酶抑制剂的研究取得了显著进展。通过对HCV NS5B聚合酶的结构特性和功能进行介绍,揭示其在病毒复制过程中的核心作用,同时,以NS5B聚合酶为靶标综述了核苷类和非核苷类2大类抗HCV抑制剂的研究进展。相关研究为抗HCV抑制剂的进一步研发提供了重要参考和思路。

核心蛋白和非结构蛋白5B直接测序法对丙型肝炎病毒基因分型的影响

目的分析HCV核心蛋白（Core）和非结构蛋白（NS）6B区直接测序的敏感性和准确性。方法收集慢性丙型肝炎患者血清51份，采用反转录PCR对Core和NS5B区分别扩增，产物直接测序，构建进化树进行基因分型。结果51份样本中，Core区扩增阳性49份，占96．1％。共检出5种基因亚型：1b为61．2％（30／49），2a为20．4％（10／49），2b为2．0％（1／49），3a为4．1％（2／49），6a为12．2％（6／49）。NSSB区扩增阳性45份，占88．2％。1b、2a、2b、3a、6a分别占62．2％（28／46）、20．0％（9／45）、2．2％（1／45）、4．4％（2／45）和11．1％（6／46）。结论与NS5B区相比，Core区引物设计容易，扩增效率和分型成功率较高，可作为HCV基因型流行病学调查和临床研究的优先选择。

丙型肝炎病毒C端截短21个氨基酸NS5B蛋白的克隆、表达及鉴定

构建HCV C端截短21个氨基酸的NS5B(HCV NS5B-C21)的重组原核表达质粒,并获得HCVNS5B-C21蛋白,为以其为靶位的抗HCV药物筛选等创造条件。利用PCR技术扩增HCVNS5B-C21基因,BamHⅠ和XhoⅠ双酶酶切后连接到经同样酶酶切的原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,获得阳性重组质粒pET-28a(+)-NS5B-C21,IPTG诱导表达,亲和层析法纯化目的蛋白表达产物经SDS-PAGE进行鉴定。成功构建了HCV NS5B蛋白表达载体pET-28a(+)-NS5B-C21,经诱导明显表达出6His-NS5B-C21,截短形式的6His-NS5B-C21表达产物的可溶性明显增加。HCV NS5B-C21蛋白在体外得到了有效表达,表达的蛋白主要存在于上清液中,纯化获得了NS5B-C21蛋白,为抗HCV药物筛选等奠定基础。

HCV NS5B蛋白对不同HCV基因型来源RNA模板复制活性的比较

目的分析HCV NS5B蛋白以不同HCV型来源的负链3’末端RNA为模板的复制活性,为优化以NS5B为靶点的抗HCV药物模型提供理论依据。方法利用原核表达系统表达HCV NS5B蛋白,Ni-NTA亲和层析柱纯化,分别以体外转录的1a(-)3′T RNA、1b(-)3′T RNA和2a(-)3′T RNA为模板进行体外RdRP反应,Northen blot检测RdRp产物。结果当以2a(-)3′T RNA为模板时,RdRp产物量最高,约为以1a(-)3′T RNA为模板时的RdRp产物量的220%,当以1b(-)3′T RNA为模板时产物量最低,约为1a(-)3′T RNA为模板时的RdRp产物量的60%。结论HCV NS5B对不同基因型来源的RNA模板具有选择性。

HCVNS5A-B片段的表达及在酶活性研究中的应用

目的利用原核表达载体pBVIL1,表达丙型肝炎病毒非结构蛋白3(NS3)丝氨酸蛋白酶催化底物NS5A-B小分子,为进一步研究蛋白酶活性提供方法学。方法将PCR合成的NS5A-B(2412-2427aa)基因直接插入高效原核表达载体pBVIL1,融合表达NS5A-B片段,包涵体形式的表达产物用8mol/L脲溶解后,采用离子交换和凝胶过滤两步纯化。利用SDS-PAGE、Western blot和ELISA方法,于37℃酶催化条件下,分析NS5A-B底物的降解活性。结果(1)构建了pBVIL1/NS5A-B重组质粒,鉴定证明NS5A-B基因片段正确地插入表达载体上。融合蛋白在转化质粒的HB101菌中得到高效表达。分离纯化重组蛋白后浓度可达0.73g/L。(2)在NS3蛋白酶作用不同时间后,用SDS-PAGE和Western blot证实,底物带可被明显降解,ELISA分析也证明,NS5A-B具有酶底物活性。结论含有酶切位点的NS5A-B融合蛋白可被NS3丝氨酸蛋白酶有效地降解,可用作为NS3蛋白酶的底物,可替代全长NS5A-B和化学合成肽用于酶活性和酶阻断剂的研究。

丙型肝炎病毒NS5B全长基因及截短形式基因的克隆、表达及鉴定

目的构建丙型肝炎病毒(HCV)NS5B-FL、NS5B-C21和NS5B-C51重组原核表达载体,并进行目的蛋白的表达及鉴定。方法利用PCR技术扩增3种长度的NS5B基因,经BamHI和XhoI双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pET-28a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达重组蛋白,并进行纯化及鉴定。结果所构建的3种重组质粒pET-28a(+)-NS5B-FL、pET-28a(+)-NS5B-C21和pET-28a(+)-NS5B-C51,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经PCR及酶切鉴定,均能扩增或酶切出相应大小的目的基因片段,表达的6His-NS5B-FL融合蛋白主要以包涵体形式存在,而表达的6His-NS5B-C21和6His-NS5B-C51融合蛋白的可溶性明显增加。纯化的6His-NS5B-C21蛋白未发生降解,6His-NS5B-FL和6His-NS5B-C51蛋白发生了部分降解。纯化后的3种蛋白均能与丙肝患者血清发生反应。结论已成功构建了3种NS5B基因的重组表达载体,并获得了目的蛋白表达,为进一步抗HCV药物的筛选奠定基础。

pSG5/NS5A5BΔC质粒的构建及在Huh7细胞中的表达

目的:构建pSG5/NS5A5B△C质粒,并检验其在Huh7细胞中的瞬时表达。方法:使用已经构建的pTM1-NS2NS5A5B△C质粒为模板,根据pTM1、HCV NS5A5B△C、pSG5序列和酶切位点特点设计引物,PCR扩增得到HCVNS5A5B△C基因片段,将目的片段插入pSG5载体中,经筛选阳性克隆、SacⅠ和BglⅡ分别酶切鉴定后,用FuGene6转染试剂转染入Huh7细胞。用免疫荧光染色、Western blot检测HCV NS5A5B△C在Huh-7细胞中的表达。结果:限制性内切酶SacⅠ和BglⅡ分别酶切鉴定后,琼脂糖凝胶电泳结果显示酶切片段大小和插入方向均与预计一致。荧光显微镜下可见转染的Huh7细胞表达带有绿色荧光的HCV NS5A5B△C蛋白,该蛋白主要表达于细胞质,表达率达40%以上。West-ern blot结果也证实在转染pSG5/NS5A5B△C的Huh7细胞中出现了大小与HCV NS5A5B△C(82ku)一致的条带。结论:成功构建了pSG5/NS5A5B△C质粒,并在Huh7细胞中成功瞬时表达,为进一步研究HCV蛋白的功能奠定了基础。

丙型肝炎病毒ns5b基因的克隆、表达及鉴定

目的 :构建HCVns5b基因的重组原核表达质粒 ,并获得NS5B蛋白的高效表达 ,为制备抗NS5B抗体及以其为靶位的抗HCV感染研究创造条件 .方法 :利用PCR技术扩增HCVns5b基因 ,XhoⅠ和KpnⅠ双酶切后连接到经同样酶切的原核表达载体pRSETA上 ,转化大肠杆菌JM 10 9菌株 ,获得阳性重组质粒pRSETA ns5b ,阳性质粒转化BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,表达产物经SDS PAGE和WesternBlot电泳进行鉴定 ,并以薄层扫描分析对其定量 .结果 :成功构建了HCVNS5B蛋白表达载体 pRSETA ns5b,经诱导明显表达出6His NS5B融合蛋白 ,表达产物主要以包涵体形式存在 ,表达量占菌体蛋白 2 5 % ,Western Blot结果显示表达蛋白保持活性 .结论 :HCVNS5B蛋白在体外得到了有效表达 .

HCVNS5B蛋白结构与功能研究进展

NS5B是一种依赖RNA的RNA聚合酶（RdRp），作为核心酶在HCV复制中起关键作用。NS5B结构和功能的研究，有助于HCV基因组RNA复制及调节、HCV与宿主相互作用的认识，同时也为以RdRp为靶标的药物研究奠定了理论基础。

丙型肝炎病毒依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)研究进展

由于缺乏合适的HCV感染细胞模型 ,严重制约了HCV复制 ,特别是HCV复制的关键因子依赖于RNA的RNA聚合酶 (RdRp)的研究 .对HCV序列比较分析并通过异源表达证明NS5B是HCV复制的RdRp .NS5BC端疏水性氨基酸区域以及NS5B与细胞膜形成复合体等影响NS5B溶解性 .在合适的反应条件下NS5B可以多种RNA分子为模板催化RNA复制 ,特别是能有效复制HCV全长 (+ )RNA .高浓度GTP激活HCVRdRp活性 .NS5BN/C端缺失突变和保守性A、B、C区中的点突变影响RdRp活性 ,但D区 345位精氨酸突变为赖氨酸时RdRp活性明显升高 .

中国人血清中丙型肝炎病毒聚合酶全长基因的克隆表达及鉴定

构建中国人丙型肝炎病毒(HCV)复制的RNA聚合酶原核表达载体pET30aNS5b,并在大肠杆菌中获得NS5B聚合酶蛋白的高效表达,为建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型的方法创造条件。使用高保真Pfu DNA聚合酶进行反转录及套式PCR扩增,从我国HCV RNA阳性血清中扩增出HCV NS5b RNA多聚酶全基因序列,经BamHI和SalI酶切,将其克隆至同样酶切的pET-30a载体中:转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。用抗HCV NS5b单克隆抗体做Western-Blot进行鉴定。结果表明构建了原核表达载体,pET30aNS5bpET30aNS5b明显表达出12-His-NS5b聚合酶蛋白。测序结果表明,与已发表的相关HCV NS5b RNA聚合酶序列比较,其核苷酸和氨基酸的同源性分别在69％～92.7％及88.8％～96.8％之间。在最佳表达条件下,可高效诱导表达融合蛋白(65kDa),最高表达量占菌体蛋白18.9％。Western-Blot结果显示表达蛋白为HCV NS5b酶。HCV聚合酶蛋白全长基因可以成功地克隆在pET-30a载体上并有效表达出目的蛋白,为研究建立HCV NS5b聚合酶细胞外分子复制模型莫定了基础。