吞蛋白A2在非网格蛋白内吞中的作用研究进展

内吞作用是细胞从细胞外空间和内化横跨膜的细胞表面蛋白转运物质到细胞内的过程.吞蛋白(endophilin)一直被认为参与了网格蛋白介导的细胞内吞作用,2015年《自然》(Nature)发表的两篇研究论文报道了一种由endophilin A标记和控制的独立于网格蛋白的有被囊泡内吞作用.本文主要综述近年来endophilin A2的研究,着重介绍endophilin A2在非网格蛋白介导的内吞作用中的功能和机制.

网格蛋白介导的内吞作用机制

受体介导的内吞作用是目前公认的生物体摄取生物大分子的途径,而网格蛋白介导的内吞又是最主要的受体介导方式.结合国内外最新报道,介绍了网格蛋白和衔接蛋白的结构、分子特性和功能;从衔接蛋白、网格蛋白的招募;包被小凹的内陷、缢缩和包被液泡的芽殖和包被液泡的脱壳等过程,阐释了网格蛋白介导的内吞作用机制.

网格蛋白介导型内吞作用与广谱抗病毒药

病毒性疾病对人类的健康造成了巨大的威胁,虽然有很多药物用于临床治疗,但由于病毒的易变异性,对现有的抗病毒药物极易产生耐药性,而新发病毒又层出不穷,因此研发新的抗病毒药物尤其是广谱且不易产生耐药的抗病毒药物对于病毒性疾病的治疗就显得尤为重要。网格蛋白介导型内吞是许多病毒和病原体进入宿主细胞的主要途径,抑制此途径可阻断病毒进入宿主细胞,从而抑制病毒感染,由于其功能和机制与病毒自身无关,不易产生耐药,是近年来广谱抗病毒药物的潜在作用靶标。本文结合国内外最新研究报道,简要综述了病毒依赖网格蛋白介导型内吞入胞的机制,网格蛋白介导型内吞抑制剂的研究现状,及其在广谱抗病毒药物研发中的潜在应用前景。

肠道病毒71型(EV71)通过网格蛋白介导的内吞途径入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞

目的研究肠道病毒71型(EV71)入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的内吞机制。方法利用氯丙嗪(CPZ)、制霉菌素(NT)分别预处理SK-N-SH细胞,实时定量PCR(qRT-PCR)检测靶细胞中EV71 mRNA水平,免疫荧光细胞化学染色检测靶细胞病毒蛋白1(VP1)蛋白表达水平;EV71感染SK-N-SH细胞后,激光共聚焦显微镜检测EV71与入侵途径标志分子网格蛋白的共定位。结果 CPZ能抑制靶细胞内EV71 mRNA和VP1蛋白的表达,而NT对其无影响;激光共聚焦显微镜发现EV71与网格蛋白共定位。结论 EV71是通过网格蛋白介导的内吞途径入侵人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞。

新城疫病毒利用网格蛋白和小窝蛋白受体途径感染鸡骨髓来源树突状细胞

新城疫病毒(NDV)可以通过多种内吞途径感染细胞,且其入胞途径可能具有细胞类型特异性。本研究以鸡骨髓源树突状细胞(chBM-DCs)为模型,探究NDV入侵该细胞的内吞途径。首先利用CPZ(CME抑制剂)和Dynasore(dynamin1/2抑制剂)预处理DCs,然后感染NDV强毒株Herts/33,通过Western blot和IFA检测NDV NP的胞内表达水平变化。药物预处理组NP的表达水平均显著降低,表明NDV能够通过网格蛋白介导的内吞途径进入DCs。进一步利用甲基-β-环糊精(MβCD)预处理DCs,然后感染Herts/33,通过Western blot和IFA检测NDV NP的胞内表达水平变化。结果显示药物预处理组NP的表达水平显著降低,表明NDV能够通过小窝蛋白介导的内吞途径进入DCs。本研究为全面阐明NDV感染宿主细胞的途径提供了理论基础。

卵黄脂磷蛋白通过网格蛋白介导的内吞作用进入培养的人成纤维细胞

为了探究从斑马鱼(Danio rerio)胚胎裂解液中纯化的卵黄脂磷蛋白(lipovitellin,Lv)进入培养的人成纤维细胞的分子途径,该研究用Sephadex G-200色谱柱结合QAE-Sephadex A50阴离子交换色谱柱从斑马鱼0 h胚胎裂解液中分离纯化出Lv。FITC标记的Lv(FITC-Lv)预先分别与Hepes、牛组蛋白、鱼精蛋白、卵磷脂、0 h胚胎胰蛋白酶水解物或者斑马鱼胚胎裂解液孵育,再加入至opti-MEM培养基中培养人成纤维细胞,培养一定时间后,用荧光倒置显微镜观察,发现Hepes和组蛋白可以促进Lv进入细胞。制霉菌素是陷窝介导的内吞作用(caveolae-mediated endocytosis)的抑制剂,氯丙嗪和蔗糖是网格蛋白介导的内吞作用(clathrin-mediated endocytosis)的抑制剂,阿米洛利是巨胞饮作用(macropinocytosis)的抑制剂。为了证实Lv进入细胞的分子途径,在FITC标记Lv与人成纤维细胞的培养体系中,分别加入上述抑制剂。结果发现氯丙嗪和蔗糖可以抑制Lv进入细胞。该研究获得如下结论:纯化的斑马鱼Lv单独不能进入细胞,在组蛋白的协同作用下,Lv通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞。该研究将为进一步研究Lv进入细胞发挥生物学功能奠定基础。

细胞内吞循环运输通路及其分子调控机制

内吞运输对于细胞与外界的物质信息交流至关重要,其过程涉及对胞外大分子、膜磷脂、膜蛋白内吞及分选的精细调控。在内吞运输系统中,循环运输通路负责将膜蛋白和磷脂等送回质膜,维持质膜组成的稳定,保障多种细胞生物学过程的正常进行,如营养吸收、细胞极性形成、细胞迁移、细胞分裂、突触可塑性、免疫应答、生长因子受体调控等。真核细胞中存在两大类循环运输通路,分别是网格蛋白依赖内吞货物蛋白的循环运输(CDE货物循环)和非网格蛋白依赖内吞货物蛋白的循环运输(CIE货物循环)。在体内具有重要生理功能的转铁蛋白受体TfR和低密度脂蛋白受体LDLR是CDE循环的代表性货物膜蛋白。近年,受CIE货物循环调控的重功能膜蛋白被逐步发现,如IL2受体α-亚基、主要组织相容性复合体MHCClassⅠ、葡萄糖转运因子GLUT4等。因而,对CIE货物循环调控机制的研究越来越受到学界关注,相关研究既有重要的细胞生物学理论意义,也能为诸如Ⅱ型糖尿病和癌症等重大疾病的诊疗策略提供科学依据和潜在治疗线索。相较于CDE货物循环,学界对CIE货物循环的研究开展较晚,对其调控机制的了解也较少。为此,本文在介绍内吞循环运输通路类型及其特点的基础上,着重关注CIE循环运输调控的分子基础,对CIE货物循环研究领域的新进展、新研究体系进行了归纳和说明。

流感病毒和冠状病毒的细胞表面结合与内化

病毒是一种在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物.不同病毒侵入细胞的方式不同,但大都需要通过结合至细胞表面特定的受体蛋白或脂质结构来实现细胞内化,从而启动入侵程序和感染宿主细胞.因此揭示病毒结合和内化侵入细胞的具体过程及机制有助于从源头上开发靶向药物或疫苗.本文以流感病毒和冠状病毒为例,首先介绍了流感病毒的结构,其与细胞膜上特定种类蛋白或脂质结构的结合方式,其完成细胞内吞的途径及诱导其内化的细胞因子种类,以及侵入细胞后的作用过程,继而对冠状病毒尤其针对目前仍在全球范围内肆意传播的新型冠状病毒(SARS-CoV-2),扼要阐述了其结构特点、与细胞受体血管紧张素转化酶ACE2的结合及实现细胞内化的研究进展.

Endophilin-A1的功能和作用机制及与认知功能的关系

最近国内外研究提示endophilin-A1在多种认知功能损害性疾病,如阿尔茨海默病(AD)和糖尿病认知功能损害中异常表达。Endophilin-A1是一种广泛表达于脑的突触前神经终末的胞浆蛋白,在突触囊泡的内吞回收,尤其是网格蛋白介导的囊泡内吞(CMVE)过程中起重要作用。研究认为其本身可能调节Aβ的生成,也可能通过CMVE来影响脑内Aβ的生成与释放,提示其与AD的发病有关。此外,endophilin-A1在糖尿病认知功能损害的大鼠脑内表达下调。本文就近年来endophilin-A1的研究进展作一综述。

内吞相关蛋白Myosin Ⅵ/Disabled-2在小鼠耳蜗毛细胞的表达及年龄相关性变化的研究

目的:研究不同年龄小鼠耳蜗毛细胞内吞相关蛋白MyosinⅥ和Disabled-2(Dab2)的表达及分布特点。方法:分别选取出生后2周、5周、9周及16月龄的昆明小鼠各10只,采用免疫荧光标记联合激光共聚焦显微镜扫描耳蜗基底膜铺片,观察MyosinⅥ及Dab2蛋白的表达定位,通过荧光定量逆转录PCR测定并比较不同年龄组小鼠耳蜗2种蛋白mRNA的表达水平。结果:MyosinⅥ及Dab2蛋白在内外毛细胞均有表达,支持细胞未见表达,且内毛细胞2种蛋白均存在局部高表达的亚细胞区域。比较不同年龄组MyosinⅥ荧光染色图像后发现,2周龄和16月龄小鼠荧光强度均低于5周龄和9周龄小鼠。比较不同年龄组小鼠2种蛋白mRNA表达后发现,2周龄小鼠mRNA相对表达水平均低于9周龄小鼠,差异有统计学意义(P<0.01),5周龄及16月龄组小鼠分别与9周龄小鼠相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:调控网格蛋白介导内吞过程的MyosinⅥ及Dab2蛋白表达于内外毛细胞,内毛细胞顶区表皮板及附近胞质可能是这一过程的主要部位。随着年龄的增长,MyosinⅥ及Dab2蛋白的表达可能会发生改变,网格蛋白介导内吞过程效率可能因此相继发生变化,内毛细胞功能损伤可能与此有关。

非病毒载体介导的siRNA细胞内导入机理研究

比较了两类非病毒载体,包括阳离子聚合物载体(HPAMAM-PHE45,PEI)和阳离子脂质载体(DOTAP)运载siRNA进入细胞的动态过程.DOTAP/siRNA能够很快地被内吞进入内涵体途径,6 h内就能将绝大多数的siRNA从内涵体中释放出来.而HPAMAMPHE45,PEI/siRNA复合物在与细胞接触0.5 h后首先附着在细胞膜表面,逐渐地部分复合物也经由内涵体途径将siRNA从内涵体中释放出来进入细胞质.但也有一部分复合物可能从窖蛋白介导的内吞途径进入细胞.实验结果显示,细胞摄取阳离子脂质/siRNA主要通过网格蛋白介导的内吞实现,而阳离子聚合物/siRNA主要通过网格蛋白介导的内吞和窖蛋白介导的内吞共同完成.这两种不同的内吞方式可能对非病毒载体的不同转染机理及优化理论有较大影响.深入研究其中的关键因素可以为非病毒载体运载siRNA内吞和胞内途径的机理提供线索.

SARS-CoV-2入胞活细胞示踪平台的建立

新型冠状病毒(SARS-CoV-2)由于其高传染性已造成全球大流行。目前关于SARS-CoV-2依赖内吞途径进入细胞的研究偏向于药物抑制实验或固定样品的蛋白共定位实验,而对于其入胞时与细胞内吞结构相互作用的动力学机制研究较少。本研究首先基于慢病毒系统包装出可在生物安全二级实验室(BSL-2)进行操作的SARS-CoV-2假病毒,之后利用膜染料对假病毒的囊膜进行荧光标记,并进行鉴定。通过免疫荧光方法观察到假病毒与网格蛋白包被的内吞结构共定位,进一步在网格蛋白敲低的Caco-2细胞系上进行假病毒感染,检测到荧光素酶活性显著下降,这些结果确定了网格蛋白介导的内吞作用参与假病毒感染。最后基于单病毒示踪技术,通过共聚焦显微镜对假病毒入胞过程进行活细胞实时拍摄,选取两个具有代表性的假病毒粒子依赖网格途径入胞的典型视野,并对假病毒动力学进行分析。本研究成功建立了SARS-CoV-2假病毒入胞活细胞示踪平台,可应用于研究单个假病毒粒子入胞过程动力学机制。该平台对SARS-CoV-2入胞机制的研究具有重大意义。