非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链B羧基端多肽单克隆抗体的制备及鉴定

为了得到能够特异性识别非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链B(NMHCⅡ-B)的单克隆抗体,根据Marc-145细胞上NMHCⅡ-B羧基端的蛋白质序列,合成多肽,免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用ELISA方法筛选阳性克隆;制备腹水并纯化;用间接ELISA和间接免疫荧光试验检测纯化抗体的特异性。结果显示,获得2株能稳定传代并分泌特异性抗体的杂交瘤细胞系;单克隆抗体的特异性鉴定显示,2株细胞系所产生的抗体能够特异性地与NMHCⅡ-B羧基端蛋白反应而且能与Marc-145细胞产生特异性的结合。这2株单抗的制备及鉴定为研究易感细胞上NMHCⅡ-B与猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的关系奠定了基础。

非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A羧基端蛋白的真核表达及在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染Marc-145细胞中的作用

前期研究结果证明抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5蛋白的抗独特型抗体特异性结合Marc-145细胞上的非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A(Nonmuscle myosin heavy chainⅡ-A,NMHCⅡ-A)蛋白,其结合位点位于NMHCⅡ-A的羧基端。本研究通过真核表达NMHCⅡ-A的羧基端(PRA)蛋白,验证其对PRRSV感染Marc-145细胞的作用。通过Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达PRA蛋白。Western blot和间接免疫荧光鉴定PRA蛋白的表达及其与Marc-145细胞的结合。通过病毒中和试验、荧光聚焦中和试验和荧光定量PCR检测PRA蛋白对PRRSV感染Marc-145细胞的作用。Western blot和间接免疫荧光结果表明,PRA蛋白在真核细胞中得到成功表达,其最高表达量为接种1个MOI杆状病毒后96h时。PRA蛋白特异性结合Marc-145细胞,使PRRSV感染Marc-145细胞延迟24h并且感染效率降低60%。真核表达的NMHCⅡ-A羧基端蛋白能特异性结合Marc-145细胞并有效降低PRRSV的感染。这些结果为进一步阐明NMHCⅡ-A在PRRSV感染细胞过程中的作用提供了新的依据。

非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A单克隆抗体的制备及其靶位点区域的鉴定

为制备非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A(NMHC-II A)的单克隆抗体(MAb),本研究将编码NMHC-Ⅱ A羧基端1 651～1 960氨基酸的表达重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞Rosseta中诱导表达,重组蛋白纯化后免疫BALB/c小鼠,分离小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG 4000介导融合。ELISA方法检测筛选阳性杂交瘤细胞,制备腹水并纯化MAb,以间接免疫荧光和免疫沉淀方法鉴定MAb的特异性,western blot检测MAb靶位点区域。结果表明,通过筛选得到1株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞系,其抗体亚型为IgG1,细胞培养上清和腹水效价分别为1∶2 560和1∶1.0×106;该MAb能够特异性结合相应抗原,并结合Marc-145细胞;western blot结果显示该抗体与NMHC-Ⅱ A的1 812～1 894氨基酸位点结合。该抗体的制备为研究NMHC-Ⅱ A在猪繁殖与呼吸综合征病毒感染细胞中的作用奠定了基础。

猪NMMHC-ⅡA基因功能区的克隆及表达特征分析

为了解NMMHC-ⅡA是否与不同品种猪对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的抗性差异有关,本研究克隆了对PRRSV易感的三元杂交猪(杜大长)、抗PRRSV的我国优良地方品种莱芜猪和大蒲莲猪NMMHC-ⅡA基因中含PRRSV结合区(23个氨基酸)在内的羧基端954bp的cDNA序列,并分析了其在物种间的同源性和在不同品种间的差别,通过RT-PCR法检测了该基因在猪体内的表达特征。结果表明,NMMHC-ⅡA的cDNA序列在哺乳动物中的保守性较高,猪与人、大鼠、小鼠、牛、猴、狗等物种的核苷酸及氨基酸序列同源性均较高;莱芜猪、大蒲莲猪及杜大长杂交猪NMMHC-ⅡA蛋白羧基端的氨基酸序列完全相同,而NMMHC-ⅡA基因的核苷酸序列有3处不同。猪NMMHC-ⅡA基因在猪肝脏、肾脏、脾脏、肺脏、淋巴结、扁桃体、大肠、小肠、胃和肌肉中均有明显的表达,而在心脏和大脑中有弱表达,在小脑及子宫中几乎检测不到其表达。结果显示,对蓝耳病呈现不同抗性的杜大长杂交猪和莱芜猪、大蒲莲猪NMMHC-ⅡA基因的功能区没有区别,该基因在除小脑和子宫外的多种组织中均表达,NMMHC-ⅡA与猪抗蓝耳病的关系需进一步研究。