产耐热α-葡萄糖苷酶重组大肠杆菌的构建及发酵条件优化

以非解朊栖热菌HG102基因文库筛选的重组质粒pUC18-atgly为模板PCR扩增α-葡萄糖苷酶结构基因,与表达载体pET28α(+)连接,转入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达.对重组菌的产酶条件进行了初步优化,最终酶活由4.25U/mL提高到40.85U/mL.

耐热β-糖苷酶的基因克隆、表达和耐热性研究

从非解朊栖热菌HG10 2 (Thermusnonproteolyticus)染色体文库中 ,筛选得到耐热 β 糖苷酶 (Tn gly)基因。该基因位于重组质粒 2 6kbHindⅢ插入片段上 ;并在E .coli中表达 ,酶比活力提高 17倍。经序列测定 ,该基因1311bp ,编码 436个氨基酸 ,前端与部分糖透性酶基因紧密相连 ,G +G含量为 71% ,有明显的RBS序列 ,启动子序列不明显。经序列同源性比较 ,其氨基酸序列属糖苷水解酶家族 1,有 N E P 和 T E N 保守序列 ,Glu16 4和Glu338推测是催化活性中心。其氨基酸组成中 ,疏水氨基酸含量较高 (Ala 12 .8%、Leu 10 .9% ) ,Arg(9 6 % )、Glu(9 44 % )和Pro(8.0 % )含量显著较高。理论预测二级结构中 ,α 螺旋占 41 4% ,β 折叠占 16 2 % ,β 转角占 14 4% ,并有大量的Pro位于 β 转角的第二位。疏水作用、盐键、α 螺旋和Pro对Tn gly的突出热稳定性有重要贡献。经系统进化树分析发现 ,β