羧甲基茯苓多糖对肠道病毒71型的抗病毒活性及其机制研究

为研究羧甲基茯苓多糖(CMP)对肠道病毒71型(EV71)的抗病毒活性,并探讨其作用机制,采用CCK-8法检测CMP对人恶性胚胎横纹肌瘤细胞(RD细胞)增殖的影响;采用致细胞病变效应(CPE)法观察CMP对EV71感染引起的CPE的抑制作用;采用致半数细胞病理改变的病毒感染剂量(TCID50)法检测CMP对EV71感染性病毒颗粒的抑制水平;采用RT-qPCR法检测EV71结构蛋白VP1的表达;采用Western blotting法分析VP1、P62、LC3、Caspase-3、cleaved Caspase-3蛋白的表达。结果表明:不同质量浓度(0、250、500、1000μg/mL)CMP对RD细胞无明显的细胞毒性;与对照组相比,CMP在无毒性浓度范围内可有效抑制EV71的复制,且能够呈剂量依赖性地降低病毒感染引起的细胞病变效应;CMP可呈剂量依赖性地降低EV71病毒结构蛋白VP1的表达和子代感染性病毒颗粒的产生;CMP可下调EV71病毒感染的RD细胞中的LC3-Ⅱ、cleaved Caspase-3的表达。

上海市长宁区儿童家长肠道病毒71型灭活疫苗接种意愿及影响因素分析

目的 了解上海市长宁区托幼机构儿童家长为孩子接种肠道病毒71型灭活疫苗(EV71疫苗)的意愿并分析影响因素,为推广EV71疫苗接种提出建议。方法 采用随机抽样的方式抽取长宁区托幼机构就读的儿童,向儿童家长发放问卷进行调查。结果 有75.40%的家长愿意为孩子接种EV71疫苗。Logistic回归分析,不认为EV71会产生强烈副作用、疫苗犹豫量表得分越高、主动获取知识得分越低的家长更愿意为孩子接种EV71疫苗。结论 家长为儿童接种EV71疫苗的意愿受到对EV71疫苗副作用的认知、疫苗犹豫和主动获取知识情况的影响,应对家长开展相关健康教育,以提升接种率。

6-35月龄儿童接种肠道病毒71型灭活疫苗的手足口病保护效果和不良反应观察究

总结肠道病毒71型灭活疫苗(EV71)在用于6-35月龄儿童手足口病预防时的效果以及安全性;方法 对在我院接种和不接种肠道病毒71型灭活疫苗的6-35月龄儿童进行随访观察,统计接种和不接种肠道病毒71型灭活疫苗的儿童在1年内手足口病发生率和疫苗接种后的不良反应发生情况;结果 接种组和不接种组儿童的手足口病发生率分别分别为2.78%和10.24%(P<0.05),EV71灭活疫苗的VE为95%CI=73.85(61.50-83.65),接种组144名儿童的接种不良反应发生率为4.17%,轻度不良反应4例、中度不良反应2例;结论 肠道病毒71型灭活疫苗对6-35月龄儿童手足口病具有较好的防护效果,且安全性也较好,适宜儿童接种应用。

延伸护理对肠道病毒71型手足口病患儿遵医行为及其家长对疾病认知度的影响

目的:探讨延续护理对肠道病毒71型手足口病患儿遵医行为及其家长对疾病认知度的影响。方法:对2021年6月至2023年6月聊城市人民医院收治的80例肠道病毒71型手足口病患儿进行回顾性研究。将进行常规护理的患儿设为对照组,共30例患儿。将进行延伸护理的患儿设为试验组,共30例患儿。评估两组患儿遵医行为(个人卫生、饮食调理、口腔卫生、消毒隔离及皮肤保护)、患儿家长对疾病认知度(疾病发生、疾病发展、疾病治疗、疾病护理及疾病预后)及患儿生活质量(身体健康、心理健康、社会交往、睡眠质量及饮食能力)。结果:试验组患儿个人卫生评分(8.64±1.54)分、饮食调理评分(8.69±1.66)分、口腔卫生评分(7.84±2.74)分、消毒隔离评分(8.64±1.25)分及皮肤保护评分(8.89±1.21)分高于对照组患儿个人卫生评分(6.51±1.28)分、饮食调理评分(6.47±1.32)分、口腔卫生评分(5.98±2.34)分、消毒隔离评分(7.26±1.11)分及皮肤保护评分(7.68±1.55)分(P<0.05)。试验组患儿家长对疾病发生认知度评分(8.65±1.88)分、对疾病发展认知度评分(9.14±0.57)分、对疾病治疗认知度评分(8.68±1.55)分、对疾病护理认知度评分(9.01±0.97)分及对疾病预后认知度评分(8.67±1.65)分高于对照组患儿家长对疾病发生认知度评分(7.21±1.65)分、对疾病发展认知度评分(6.58±0.43)分、对疾病治疗认知度评分(6.87±1.25)分、对疾病护理认知度评分(7.04±0.6)分及对疾病预后认知度评分(6.84±1.24)分(P<0.05)。试验组患儿身体健康评分(83.65±10.37)分、心理健康评分(82.28±10.56)分、社会交往评分(83.61±10.09)分、睡眠质量评分(89.97±9.32)分及饮食能力评分(89.91±9.42)分高于对照组患儿身体健康评分(75.68±10.25)分、心理健康评分(76.42±10.15)分、社会交往评分(74.28±9.92)分、睡眠质量评分(83.12±9.65)分及饮食能力评分(83.07±8.76)分(P<0.05)。结论:延续护理应用于肠道病毒71型手足口病患儿护理中,可提高其遵医行为,改善其家长对疾病的认知度,提高其生活质量,改善其预后,值得临床应用及推广。

儿童清咽解热口服液体外抗肠道病毒71型作用

目的 研究儿童清咽解热口服液体外抗肠道病毒71型(EV71)的作用。方法 以盐酸胍为阳性对照,在Vero-E6细胞水平上,采用CellTiter-GloTM测定受试样品的细胞毒性,采用间接免疫荧光法测定肠道病毒蛋白表达水平,评价儿童清咽解热口服液对EV71的抗病毒作用。结果 儿童清咽解热口服液对Vero-E6细胞的半数毒性浓度为127.2mg/ml,抑制EV71病毒复制的半数有效浓度为3.193mg/ml,选择指数为39.8。结论 在Vero-E6细胞水平上,儿童清咽解热口服液对EV71具有明显的抗病毒作用。

直肠滴入中药对CoxA16、EV71肠道病毒感染手足口病的疗效

目的观察直肠滴入中药对CoxA16、EV71肠道病毒感染手足口病的疗效。方法选取2019年8月—2022年8月贵州水矿控股集团有限公司总医院CoxA16、EV71肠道病毒感染手足口病患儿85例,按照随机数表法分为观察组(42例)和对照组(43例),其中对照组患儿给予利巴韦林治疗,观察组患儿给予直肠滴入中药治疗。对比两组患儿治疗前后口腔疱疹、发热、皮疹等症状的评分,治疗前后患儿炎症因子、免疫指标水平及两组患儿治疗后不良反应发生率。结果治疗前,两组患儿的口腔疱疹、发热、皮疹评分差异无统计学意义(P>0.05),治疗后,两组患儿的口腔疱疹、发热、皮疹评分均降低,并且治疗后观察组患儿的以上症状评分低于对照组(P<0.05);治疗后,两组患儿白细胞介素(IL)-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)-α均降低,并且治疗后观察组患儿的以上降低幅度大于对照组(P<0.05);治疗后,两组患儿CD4^(+)、CD3^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)水平均升高,CD8^(+)水平降低,并且治疗后观察组患儿的变化幅度大于对照组(P<0.05);观察组患儿不良反应发生率为4.76%,对照组患儿不良反应发生率为18.60%,观察组不良反应发生率低于对照组(P<0.05)。结论给予CoxA16、EV71肠道病毒感染手足口病患儿直肠滴入中药治疗,能减轻患儿临床症状及炎性反应,改善免疫功能,且不良反应少,值得借鉴。

2017-2020年江门地区儿童手足口病流行病学特征及非EV71型非CA16型肠道病毒型别分析

目的:分析广东省江门市2017-2020年手足口病的流行特征,了解非EV71型非CA16型肠道病毒的分子流行病学特征,为本市进一步临床治疗和防控工作提供科学依据。方法:通过全国传染病报告信息管理系统收集2017-2020年本市手足口病患儿资料,收集整理2017-2020年本院信息系统报告的手足口病例及分析其流行特征,采用荧光RT-PCR法对疑似手足口病患者标本同时进行EV通用型、EV71型、CA16型检测,并选取EV71型和CA16阴性而EV通用型阳性的标本进行型别鉴定,设计5’非编码区特异性引物,RT-PCR扩增后进行序列测定,最后对核苷酸的同源性进行比对及确定病毒的型别。结果:2017-2020年江门市共报告HFMD总发病人数为31 709例,其中2017年报告病例数最高。4年内共采集了因怀疑手足口病到本院就诊患儿的2 587例标本,并同时进行EV通用型、EV71型、CA16型检测,总阳性1 263例,总阳性率为48.82%。阳性主要以托幼儿童和男患儿为主。其中EV71核酸阳性173例,占13.70%;CA16核酸阳性282例,占22.33%;其他EV核酸阳性808例,占63.97%。在2017-2020年中确定属于肠道病毒分型共87份,检出的非EV71型非CA16型的肠道病毒有6种型别,分别为CA6、CA10、CA4、CA12、CA5、CA8,其中CA6是占主要的,为70.11%,其次是CA10占13.79%。结论:江门市手足口病的分布呈现出人群差异、季节差异,非EV71型非CA16型的肠道病毒病原谱有六种,病毒型别以CA6为主。应持续进行病原学检测,掌握优势型别,为防控提供依据。

非融合绿色荧光蛋白标记EV71型人肠道病毒的构建

目的构建非融合绿色荧光蛋白(EGFP)标记的肠道病毒71型(EV71),为EV71抗病毒机制研究及抗病毒药物的筛选提供方法。方法取野生型病毒EV71,在EV71基因组的3D蛋白编码区后添加HBV的link序列,将EGFP基因连入link与EV71型病毒3'非翻译区之间,构建EGFP标记的EV71病毒基因组,并转染横纹肌瘤RD细胞以获得EV71-link-EGFP重组病毒。采用PCR方法鉴定重组病毒中link、EGFP位置。感染RD细胞后24、48、72、96、120、144和168 h时收获病毒,采用组织半数感染量法测定病毒滴度,绘制病毒生长曲线,比较重组病毒与野生型病毒的生长动力学。RT-PCR测定EGFP转录表达。将重组病毒感染RD细胞后72 h裂解,采用Western blotting法检测RD细胞中GFP、P1蛋白的表达情况。重组病毒感染RD细胞后,经过13轮传代,Western blotting法检测EGFP基因稳定性。结果 RD细胞内表达较强的GFP荧光,病毒感染细胞后病毒的mRNA正常表达,重组病毒中link序列、EGFP基因链接位置正常,证实EV71-link-EGFP重组病毒拯救成功。重组病毒滴度的曲线峰值与野生型病毒滴度的峰值相同。重组病毒中EGFP的表达在48 h时最高。重组病毒中GFP和P1蛋白表达正常稳定。经过13轮传代,第13代重组病毒表达的GFP蛋白与第1代无明显差别。结论通过添加link序列成功构建了非融合表达的EV71-link-EGFP重组病毒,可在RD细胞中良好生长并高效表达EGFP,且具有稳定的遗传性。

湖北肠道病毒EV71型流行株VP1基因以及蛋白结构特征分析

目的全面研究和了解2011年湖北省肠道病毒71型的VP1基因及蛋白结构特征，分析EV71型病毒在湖北省的基因型别，探讨该型病毒在全省的地理分布特征。方法对2011年湖北省8个区市的20株EV71流行株进行VP1区全长基因序列测定，并对核苷酸序列进行同源性比较及系统进化分析，并对VP1蛋白序列的亲水性、柔韧性等二级和三级结构进行分析。结果2011年湖北省EV71型流行株的基因亚型为C4a亚型，其VP1区核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性较高，分别为96．5％～98．7％和98．3％～100％。VP1蛋白特征分析发现该区主要免疫表位均没有发生变异且存在较多亲水性区域。二级结构以无规则卷曲为主，其次为8片层。蛋白质同源建模未发现不同毒株间VP1蛋白三级结构差别。结论2011年湖北省Ev71型流行株与我国其它地区的毒株有较高同源性，且存在一定的地理区域聚集性特征和遗传多样性特点。同时综合多种方法预测EV71VP1的二级结构和三级结构，为进一步研究开发相关药品和防治EV71感染提供理论基础。

肠道病毒71型(EV71)感染性克隆的构建

目的构建肠道病毒71(enterovrius 71,EV71)的感染性克隆,为研究EV71毒力基因及新型疫苗设计等建立一个技术平台。方法用RT-PCR方法扩增出EV71FJ08149株全基因组,通过TA克隆组装进TOPO-XL-PCR载体中,获得全长cDNA克隆pFJ08149T5和pFJ08149T25。应用T7聚合酶系统在体外将线性化后全长cDNA克隆转录出RNA并转染RD细胞。通过间接免疫荧光试验、RT-PCR、序列测定及免疫电镜等对拯救病毒进行鉴定。结果 RNA转染后72h观察到典型的肠道病毒致细胞病变,拯救病毒经RT-PCR、间接免疫荧光和免疫电镜检测鉴定为EV71型,表明已成功构建了EV71感染性克隆。结论本研究成功构建出具有感染性的EV71全长cDNA克隆,为深入研究EV71的致病机制等提供了有利的工具。

SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR测定肠道病毒71型(EV71)RNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定实验动物等来源的EV71病毒RNA。方法运用EV71VP1保守区引物,优化real time RT-PCR条件,运用NASBA方法扩增EV71病毒RNA,计算拷贝数,经10倍系列稀释做出标准曲线,作为EV71病毒RNA定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100copies/μL,PCR扩增效率达到99.5%。结论 SYBRGreenⅠ荧光染料实时定量PCR法测定EV71病毒RNA拷贝数的方法敏感性高、稳定性好,可用于EV71病毒RNA载量的定量测定。

河南省2010年肠道病毒EV71型分离株全基因组序列分析

目的:了解2010年河南省流行的肠道病毒(EV)71型基因特征。方法:筛选2010年河南省分离的EV71型病毒株1株(EV71/Henan/DC/2010),进行全基因组序列测定和基因进化特性分析。结果:EV71/Henan/DC/2010与其他EV71病毒株相比,编码区无核苷酸的缺失或插入,5’UTR区和3’UTR区长度和序列有一定差异。核苷酸同源性比较显示,EV71/Henan/DC/2010与2008年北京暴发流行株同源性最高(99.2%),与安徽阜阳暴发流行株和河南省暴发流行株均具有很高的同源性(98.1%和99.1%);与EV71各亚型代表株的比较结果显示,除VP3区以外,EV71/Henan/DC/2010各区均与C4亚型代表株同源性最高;氨基酸同源性比较结果显示,EV71/Henan/DC/2010大多数核苷酸变异属无义突变,相应氨基酸并未随之发生改变。根据VP1区基因序列构建遗传进化分析树显示,EV71/Henan/DC/2010与C4亚型同属一个分支。结论:EV71/Henan/DC/2010与2008年北京EV71流行株亲缘关系最为接近,同属于C4亚型。与我省及我国既往流行毒株相比,未发生大的变异。

喜炎平注射液治疗儿童非肠道病毒71型疱疹性咽峡炎的疗效及安全性

目的:探讨喜炎平注射液治疗儿童非肠道病毒71(EV71)型疱疹性咽峡炎的疗效及安全性。方法:选择115例非EV71型疱疹性咽峡炎患儿作为研究对象,按随机数字表法分为三组。A组38例患儿给予喜炎平注射液;B组40例患儿给予喜炎平注射液联合利巴韦林注射液;C组37例患儿给予利巴韦林注射液。比较各组患儿临床症状和实验室指标改善情况。结果:治疗后,A、B组患儿发热持续时间、疱疹消退时间及饮食恢复时间明显短于C组,差异均有统计学意义(P<0.05),但A、B组间的差异无统计学意义(P>0.05)。治疗第3日,A、B组患儿的C反应蛋白水平明显低于C组,差异均有统计学意义(P<0.05),但A、B组间的差异无统计学意义(P>0.05)。三组患儿在治疗期间及治疗后均未见明显不良反应。结论:非EV71型疱疹性咽峡炎有一定自限性,早期及时给予喜炎平注射液治疗,效果较好,可明显改善患者症状,且安全性较高。

我国肠道病毒71型(EV71)疫苗株生物信息学分析

目的 比较3个EV71疫苗株病毒的生物信息学特点,为疫苗的质控和探讨该病毒疫苗的免疫机制提供参考.方法 本研究利用DNAstar MegAlign、DNAMAN Alignment、ANtheProt等生物学软件,比较了我国已进入临床试验的3家EV71全病毒灭活疫苗毒株的基因组及氨基酸序列,并对英衣壳蛋白二级结构及可能存在的抗原表位进行了预测分析.结果 3个疫苗株病毒基因同源性为97％～99％；氨基酸同源性为98％～99％；二级结构一致率在95％以上；均存在35个潜在抗原表位区域.结论 3个疫苗株生物信息学分析结果存在高度的一致性,提示疫苗具有相似的抗原性和免疫原性.

新型肠道病毒71型(EV71)疫苗质量控制和评价标准的研究

目的研究建立新型肠道病毒71型(EV71)疫苗质量控制标准和评价体系,为EV71疫苗研发提供基础。方法根据创新型疫苗研发的要求,充分发挥技术优势,开展EV71疫苗质控标准、标准品和评价方法研究。结果与结论建立EV71灭活疫苗的中和抗体和抗原定量测定标准品,统一不同企业疫苗的质控标准,规范疫苗的评价体系,为EV71疫苗的研发提供保障。

肠道病毒EV71型浙江分离株HZ08全基因组序列分析

目的了解浙江省流行的肠道病毒71型HZ08株的基因特征,研究肠道病毒71型的进化及变异状况。方法设计特异性引物,RT-PCR扩增HZ08株全基因,PCR产物纯化后克隆于T载体并进行序列测定和基因进化分析。结果 HZ08株的全基因组由7 405个核苷酸组成,编码2193个氨基酸。HZ08的5非编码区(UTR)、VP1、VP2、VP3、VP4、P2、P3、3非编码区(UTR)和全基因组的核苷酸与C4亚型的毒株序列较高,分别为96.2%~99.1%,92.6%~99.1%,92.7%~98.4%,88%~99.2%,93.8%~99.5%,89.4%~99.2%,91.4%~98.8%,87.8%~100%和91.1%~98.9%。HZ08株与其他亚型各区段的核酸同源性均低于90%。根据VP1基因和全基因序列进行种系统发生分析显示HZ08株与中国陆和台湾的病毒进化关系较近,与国际标准株以及东南亚毒株进化关系统较远。其中HZ08株与国内流行株BJ08和Fuyang08的进化关系最近。HZ08株与C4亚型相关氨基酸序列一致,VP1的抗原性表位发生了变异。结论 HZ08病毒分离株为C4亚型,与Fuyang08和BJ08株进化途径相同,为肠道病毒71型的基因组功能学和疫苗学研究奠定基础。

基于聚邻苯二胺/石墨烯修饰电极的肠道病毒71型(EV71)电化学免疫传感器

采用改性的Hummers法制备石墨烯氧化物(GO),并将其滴涂在玻碳电极(GCE)表面。通过电化学还原将GO还原为石墨烯,并进一步采用电化学聚合法在石墨烯表面形成聚邻苯二胺(PoPD)膜,从而制备了PoPD/石墨烯修饰GCE。将EV71抗体固定在修饰电极表面,制备新型的电化学免疫传感器。当发生免疫反应时,由于EV71抗原与抗体生成的免疫复合物阻碍了电子的传递,PoPD的氧化峰电流下降。当抗原的浓度在0.1-80ng/mL范围内,PoPD氧化峰电流的降低值与抗原的浓度成正比。该免疫传感器对EV71的检测限为0.08ng/mL(信噪比为3)。

IL-6和IL-13与EV71型肠道病毒感染手足口病患者发病的相关性

目的观察肠道病毒71型(EV71)感染手足口病(HFMD)患者血清白细胞介素(IL)-6和IL-13水平变化情况及其临床意义,并对血清IL-6和IL-13细胞来源进行初步的探讨。方法采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法测定HFMD患者和健康对照血清中IL-6和IL-13水平,比较不同严重程度的HFMD患者血清中IL-6和IL-13水平,并同时检测HFMD患者治疗后血清IL-6和IL-13水平变化情况。流式细胞术(FCM)分析外周血单个核细胞(PBMC)中单核细胞分泌IL-6和T细胞分泌IL-13的情况。EV71病毒感染健康人单核细胞和T细胞后,FCM检测单核细胞分泌IL-6和T细胞分泌IL-13变化情况。结果 EV71感染HFMD患者血清IL-6和IL-13水平分别为(79.63±29.45)pg/mL和(36.45±15.13)pg/mL,健康对照组血清IL-6和IL-13水平分别为(27.26±7.82)pg/mL和(13.46±3.14)pg/mL,HFMD患者血清IL-6和IL-13水平显著高于健康对照者(P<0.01),同时,随着HFMD患者疾病严重程度增加,血清IL-6和IL-13水平亦逐渐升高(P<0.01)。治疗后HFMD患者血清中IL-6和IL-13水平分别为(48.23±23.14)pg/mL和(23.25±9.63)pg/mL,与治疗前相比显著降低(P<0.01)。HFMD患者外周血单核细胞分泌IL-6水平和T细胞分泌IL-13的水平与健康对照者相比显著升高;EV71病毒处理健康人单核细胞和T细胞后单核细胞和T细胞分泌IL-6和IL-13能力显著升高。结论 EV71病毒可能时通过促进单核细胞分泌IL-6和T细胞分泌IL-13,致使血清IL-6和IL-13水平升高,从而参与HFMD的发生和发展。

肠道病毒EV71新型VLPs疫苗的制备及鉴定

目的制备肠道病毒71型(EV71)的新型病毒样颗粒(VLPs)疫苗,为手足口病防治奠定基础。方法应用分子克隆技术构建外壳蛋白VP1融合基因cVP1,免疫细胞化学及Western Blot测定该融合基因在HeLa细胞表达情况;将cVP1克隆于杆状病毒表达载体pFastbac1,应用昆虫细胞TN5制备重组杆状病毒cVP1 rBV,再将此重组病毒与本室保存的gag rBV以不同MOI比例共感染昆虫细胞TN5,得到含有VP1的重组嵌合病毒样颗粒cVP1 VLPs,最后以Westem Blot及电镜进行鉴定。结果免疫细胞化学及Western Blot结果显示构建的融合基因cVP1可在真核细胞内表达,并成功制备成cVP1 rBV,该重组杆状病毒和gag rBV共感染昆虫细胞制备的VLPs结构完整。结论成功制备了EV71的新型VLPs疫苗,为后续研究打下了基础。