胚胎面突外胚间充质干细胞向成骨细胞分化的实验研究

目的 探讨人胚胎面突外胚间充质干细胞向成骨细胞分化的可能性。 方法 将妊娠 5 0天人胚胎面突外胚间充质干细胞 ,培养于含 10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10 0 μg/ml维生素 C、10 nmol/L地塞米松和 15 %胎牛血清的DMEM矿化诱导液中。相差显微镜下观察细胞的形态变化 ,免疫组织化学检测 型胶原的表达 ,碱性磷酸酶活性检测 ,矿化结节 Von Kossa染色 ,逆转录聚合酶链反应 ( reverse transcription- polymerase chain reaction,RT- PCR)检测骨钙素的表达。 结果 诱导 3天 ,细胞体积变大 ,由成纤维样变扁平 ,密集处细胞呈多边形、立方形 ,抗 型胶原染色阳性 ,碱性磷酸酶活性增高 ;15天后有矿化结节形成 ;2 5天 Von Kossa染色阳性。RT- PCR显示诱导细胞表达成骨细胞特异的骨钙素。

体外三维培养下诱导人胚胎面突外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化

目的 :探讨人胚胎面突外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的过程。方法 :采用体外细胞三维立体培养的方法 ,在转化生长因子 β1 ( TGFβ1 )、牙本质非胶原蛋白 ( DNCP)的诱导下 ,通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法 ,探索外胚间充质干细胞向成牙本质样细胞分化的可能性及生长因子在其中所起的作用。结果 :人胚胎面突外胚间充质干细胞在胶原中生长良好。培养 4d,在 TGFβ1 +DNCP组中细胞出现核极化 ,有很长的突起 ,细胞平行排列。诱导的细胞有许多与成牙本质细胞相似的超微结构。抗牙本质涎蛋白( DSP)呈阳性反应。碱性磷酸酶活性增强。细胞在矿化液中能形成矿化结节。RT-PCR显示 m RNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白 ( DSPP)。结论 :三维立体培养下 ,人胚胎面突外胚间充质干细胞在 TGFβ1及 DNCP的作用下能分化为成牙本质样细胞。本结果将外胚间充质干细胞作为前体 ,诱导分化出成牙本质样细胞 ,为研究牙齿的发育及分化提供了良好的模型和实验依据。

面突外胚间充质干细胞在体外的自发分化

目的 :探讨无人为抗分化因素干扰下 ,具干细胞特性的面突外胚间充质细胞在体外自发分化的方向。方法 :取第 4代外胚间充质干细胞 ,去除抑制分化的白血病抑制因子 (LIF) ,2d、2周爬片 ,免疫细胞化学法检测细胞分化情况。结果 :去除LIF ,细胞形态发生改变 ,由成纤维样变得多样化 ,随时间的延长而明显。去除LIF 2d ,细胞不再表达HNK - 1、NSE、S - 10 0 ,约 6 5 %细胞表达a-SMA ,I型胶原出现表达。去除LIF2周 ,约 1%细胞表达NF ,零星细胞表达GFAP。结论 :外胚间充质干细胞在体外出现自发分化 。

面突外胚间充质干细胞在体内的自发分化

目的:探讨面突外胚间充质干细胞在体内自发分化的情况。方法:取第7代外胚间充质干细胞注射于裸鼠皮下,于第3d、1周、2周取材,HE及免疫组化染色观察细胞的生长及分化情况。结果:注射后细胞团块逐渐变小、消失。HE染色细胞形态多样,数量逐渐减少。注射后3d,细胞仍表达Vimentin,其余染色未见明显阳性,细胞趋于坏死、吸收。1周时,细胞数量少,为成纤维样细胞。2周时,细胞团消失。结论:面突外胚间充质干细胞在体内生长、分化能力不明显, 多数细胞坏死、吸收。

转化生长因子β促进面突外胚间充质干细胞向平滑肌细胞分化

目的 探讨转化生长因子 β(TGF_β)对面突外胚间充质干细胞向平滑肌细胞分化的影响。 方法 6 0pmol LTGF_β作用于面突外胚间充质干细胞 ,分别于 1d、2d后进行抗α平滑肌肌动蛋白 (α_SMA)单克隆抗体免疫组化图象分析检测 ,2d后定量RT_PCR检测α_SMAmRNA的表达。结果 免疫组化显示 ,TGF_β诱导组表达α_SMA的细胞数约为 95 % ,而未加分化抑制剂的自然分化组表达α_SMA的细胞数约为 6 5 %。图象分析显示 ,1d、2dTGF_β诱导组抗α_SMA着色平均灰度值小于未加分化抑制剂的自然分化组。定量RT_PCR显示TGF_β诱导组α_SMAmRNA量大于自然分化组。有分化抑制剂的对照组细胞不表达α_SMA。结论 TGF_β诱导组细胞表达α_SMA强于自然分化组。TGF_β可以促进外胚间充质干细胞向平滑肌细胞分化。

端粒酶在面突外胚间充质细胞干细胞中的表达

目的 :探讨面突外胚间充质干细胞的端粒酶活性状况 .方法 :体外培养妊娠 5 0d人胚胎面突外胚间充质干细胞 ,白血病抑制因子 (LIF)抑制细胞分化 ,于第 1,8,15和第2 2代免疫组化检测人端粒酶逆转录酶 (hTERT)的表达并进行图像分析 ,同时检测无LIF抑制下 ,第 5代细胞自发分化 10d端粒酶逆转录酶的表达情况 .结果 :外胚间充质干细胞表达端粒酶逆转录酶 ,表达强度随传代次数的增多而下降 .在分化状态 ,该细胞不再表达端粒酶逆转录酶 .结论 :早期胚胎面突外胚间充质干细胞具有较高的端粒酶活性 。

多种生长因子对胚胎面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的诱导作用

目的:探讨转化生长因子β1(TGFβ1)、牙本质非胶原蛋白(DNCP)、TGFβ1+DNCP、肝素+胰岛素样生长因子1(IGF-1)在诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用。方法:取妊娠12.5 d SD大鼠胎鼠颌突外胚间充质细胞(第4代),在转化生长因子β1(TGFβ1)(2 ng/mL)、牙本质非胶原蛋白(DNCP)(100μg/mL)、TGFβ1(2 ng/mL)+DNCP(100μg/mL)、肝素(1μg/mL)+IGF-1(100 ng/mL)的诱导下,通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法,探索生长因子在外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用。结果:6 d后,在DNCP、TGFβ1+DNCP作用下,胎鼠面突外胚间充质细胞出现明显的形态改变,细胞由成纤维样变为梭形,部分核极化,有很长的突起,部分细胞呈现平行排列趋势。TGFβ1组部分细胞出现极化改变。DNCP、TGFβ1+DNCP诱导组抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应,RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSPP),另外DMP1亦呈阳性表达。TGFβ1组不表达DSPP、DMP1。肝素+IGF-1组在细胞形态和蛋白、mRNA上均未出现成牙本质细胞特异的表达。结论:胎鼠面突外胚间充质细胞在DNCP和TGFβ1+DNCP的作用下能分化为成牙本质样细胞。表明在诱导中起关键作用的是DNCP。TGFβ1可诱导细胞在形态学上分化成类成牙本质细胞。本结果与该细胞在三维体系中的诱导分化结果相似,表明胚胎面突外胚间充质细胞在体外被诱导分化为成牙本质样细胞不是偶然现象,这为研究牙齿的分化和发育提供了良好的模型和实验依据。

外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶修复大鼠皮肤损伤

背景:近来多数研究将组织工程材料与干细胞或细胞因子复合来改善动物模型皮肤损伤。鼻黏膜来源的外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉可以长期保存,用于修复皮肤损伤具有独特的优势。目的:观察外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶修复大鼠皮肤缺损的效果。方法:体外培养SD大鼠鼻黏膜来源的外胚间充质干细胞,第3代细胞的培养基透析后冷冻干燥制成冻干粉。将30只皮肤缺损SD大鼠按治疗方法分为3组(n=10):损伤对照组,不接受特殊治疗作为对照;纤维蛋白胶组,局部应用纤维蛋白胶;条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶组,局部应用含有外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉的纤维蛋白胶。治疗后动态观察创面愈合情况,测量创面面积,对皮肤组织切片进行苏木精-伊红染色和CK8、P63免疫组化染色。结果与结论:条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶组创面愈合速度高于纤维蛋白胶组和损伤对照组(P<0.001)。条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶组创面表皮和真皮在21 d全部再生修复;纤维蛋白胶组再生皮肤较薄;单纯创伤组皮肤再生不完全。在大鼠模型中,外胚间充质干细胞条件培养基冻干粉复合纤维蛋白胶联合使用可以促进损伤皮肤的伤口愈合。

细胞因子体外诱导外胚间充质干细胞向树突状细胞分化

目的:探讨外胚间充质干细胞(EMSC)向树突状细胞(DCs)分化的能力。方法:利用基因重组大鼠GM-CSF和IL-3连续诱导17 d,在第19天加入基因重组大鼠TNF-α继续诱导,观察其形态、超微结构、表面标记、混合淋巴细胞反应、IL-12分泌功能等,以SD大鼠骨髓间充质干细胞向DC分化作为对照。结果:经过诱导的EMSC出现细长伪足和毛刺,变为半贴壁状态;扫描电镜显示长的细胞突起和许多毛刺;其表面标记与骨髓来源的DC相似;混合淋巴细胞反应证实其可以刺激淋巴细胞增殖;诱导后的EMSC有分泌IL-12功能。结论:EMSC在体外经诱导可向DC分化。

BALB/c胎鼠面突未分化外胚间充质细胞的体外培养

目的：建立ＢＡＬＢ／ｃ近交系胎鼠面突的未分化外胚间充质细胞的体外培养模型。方法：处死妊娠１２ｄ的孕鼠，取胎鼠面突中的外胚间充质细胞，采用组织块原代培养法进行细胞培养，并进行生长曲线的测定和免疫组化的来源鉴定。结果：成功地培养出面突中未分化的外胚间充质细胞。结论：原代培养的外胚间充质细胞生长稳定，来源明确。

DNCP诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的浓度优化

目的探讨牙本质非胶原蛋白(DNCP)诱导大鼠面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的最适浓度。方法取妊娠12.5d SD大鼠胎鼠第4代下颌突外胚间充质细胞,DNCP诱导浓度分别为10、50、100、200、500、1 000μg/mL,观察细胞形态变化,诱导6d后采用定量RT-PCR检测牙本质涎磷蛋白(DSPP)、牙本质基质蛋白1(DMP1)的表达。结果6d后除10μg/mL组和1000μg/mL组外,其他诱导组细胞出现极性改变,部分细胞出现平行排列趋势;细胞表达DSPP和DMP1,以200μg/mL组最强,500μg/mL组和200μg/mL组表达量相当,而1 000μg/mL组细胞死亡。结论在DNCP诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中过低浓度不利于成牙本质细胞的分化,而过高浓度则引起细胞死亡。200μg/mL是较为合适的有效诱导浓度。

颌突外胚间充质干细胞参与颅骨缺损修复的作用

目的:探讨颌突外胚间充质干细胞参与颅骨缺损修复的作用。方法:将外胚间充质干细胞复合煅烧骨后移植入大鼠颅骨缺损处,以大鼠成纤维细胞、空白胶原作为对照,1、3、6个月后取材,经HE染色,Mallory改良三色法鉴定。结果:HE染色结果显示实验组成骨的效果明显好于对照组;图像分析见实验组的骨基质面积明显多于对照组,统计学分析P<0.01,有明显差异。结论:提示移植的外胚间充质干细胞在局部颅骨组织内存活并具有一定的功能。

颌突外胚间充质干细胞(EMSCs)的体外分离及鉴定

外胚间充质(ectomesenchyme)是一种胚胎发育早期颅面部出现的多能性结构(multipotentstructure) ,大多数颅面部结构和组织均由其衍生而来,这提示外胚间充质中存在一种干细胞,即外胚间充质干细胞(ectomesenchymalstemcells,EMSCs)。为了分离和鉴定EMSCs,对E1 2 5的SD大鼠颌突组织细胞进行了流式细胞学分析,发现其中的外胚间充质细胞表达多种神经谱系和中胚层谱系的标志,包括p75、CD5 7和nestin等。根据此特点,采用磁细胞分离技术对p75 +的颌突外胚间充质细胞进行了分离和克隆培养。克隆分析表明,单个p75 +细胞经过1 0～1 4d培养,可以形成由两种或两种以上细胞组成的多潜能性克隆(multipotentclone) ,提示该群外胚间充质细胞具有多潜能性。同时,亚克隆分析表明,多潜能性子克隆中的单个p75 +细胞具有再次形成多潜能性克隆的能力,说明这些细胞在体外具有自我更新的能力。这些结果提示,p75 +细胞同时具有多潜能性和自我更新能力,因此是外胚间充质干细胞。该干细胞的分离对于口腔颅面部的起源和发育研究无疑具有重要意义。此外,该干细胞的高度可塑性也预示它可以作为一种新的种子细胞,为组织工程皮肤、肌肉、软骨的研究提供新思路。

诱导颌突外胚间充质干细胞向骨骼肌细胞分化

目的:探讨外胚间充质干细胞(Ectomesenchymal stem cells,EMSC)向骨骼肌细胞分化的能力。方法:利用二甲基亚砜(Dimethyl sulphoxide,DMSO)液诱导外胚间充质干细胞分化,通过免疫组化和逆转录聚合酶链式反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)鉴定,以大鼠成纤维细胞作为对照。结果:RT-PCR结果说明诱导的外胚间充质干细胞表达骨骼肌细胞特异标志(Desmin)。而对照组细胞形态未出现变化,也无骨骼肌细胞标志表达。结论:外胚间充质干细胞经DMSO液诱导后可成为骨骼肌细胞。

牙胚细胞条件培养液诱导大鼠胚胎面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化

目的:探讨牙胚细胞条件培养液(TGC-CM)在诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化中的作用。方法:取妊娠12.5dSD大鼠胎鼠第4代下颌突外胚间充质细胞,在牙胚细胞条件培养液(TGC-CM)的诱导下,通过形态学观察、免疫组化、RT-PCR等方法,探索牙胚细胞条件培养液诱导面突外胚间充质细胞向成牙本质样细胞分化的可能。结果:面突外胚间充质细胞在诱导培养基中生长良好。培养7d,在诱导组中细胞出现核极化,有很长的突起,细胞平行排列。抗牙本质涎蛋白(DSP)呈阳性反应。RT-PCR显示mRNA水平表达成牙本质细胞特异的牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白-1(DMP-1)。结论:面突外胚间充质细胞在含有多种细胞因子的TGC-CM的作用下能分化为成牙本质样细胞,能为研究牙齿的分化和发育提供良好的模型和实验依据。

诱导颌突外胚间充质干细胞向成骨细胞分化

目的:探讨外胚间充质干细胞向成骨细胞分化的能力;方法:利用矿化液诱导外胚间充质干细胞分化,通过免疫组化和RT-PCR鉴定,以大鼠成纤维细胞作为对照。结果:显示外胚间充质干细胞经矿化液诱导后,细胞形态发生变化,细胞形态为立方状,紧密排列,类似成骨细胞,随着培养时间增长,可形成矿化结节;免疫组化显示诱导的外胚间充质干细胞表达I型胶原;RT-PCR结果说明诱导的外胚间充质干细胞表达成骨细胞特异标志-骨桥素mRNA。而对照组细胞形态未出现变化,也无成骨细胞标志表达。结论:外胚间充质干细胞经矿化液诱导后成为成骨细胞。

Necdin对大鼠牙胚外胚间充质干细胞成牙分化和矿化的影响

目的探讨胚胎癌细胞来源分化神经元特异蛋白(neurally differentiated EC-cell-derived protein,Necdin)对大鼠牙胚外胚间充质干细胞(ectomesenchymal stem cells,EMSCs)成牙分化和矿化的调控作用。方法利用免疫荧光染色检测Necdin在E13.5d、E19.5d大鼠牙胚中的表达分布情况。分离培养E19.5d大鼠牙胚EMSCs,流式细胞术鉴定细胞表型,构建Necdin沉默慢病毒感染EMSCs,分为阴性对照组(sh-NC)和沉默组(sh-Necdin)。流式细胞术检测EMSCs凋亡情况,CCK-8法检测EMSCs增殖能力,划痕实验检测EMSCs迁移能力,矿化诱导后通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色、RT-PCR和Western blot观察Necdin对EMSCs成牙分化和矿化的调控作用。结果免疫荧光显示Necdin在内、外釉上皮和上皮与间充质接触区域呈强阳性表达;牙胚组织来源的EMSCs沉默Necdin后,sh-Necdin组EMSCs凋亡率较sh-NC组增多(P<0.01),与sh-NC组相比,sh-Necdin组EMSCs的增殖能力更强(P<0.01),但迁移能力变弱(P<0.01);与sh-NC组相比,sh-Necdin组碱性磷酸酶染色更浅且矿化结节形成更少;sh-Necdin组EMSCs成牙分化和矿化相关的基因与蛋白表达量明显低于sh-NC组(P<0.05)。结论Necdin在大鼠牙胚未来成牙分化和矿化区域呈特异性表达,沉默Necdin促进EMSCs凋亡和增殖,但抑制EMSCs迁移以及成牙分化和矿化,Necdin可能在牙发育矿化过程中发挥重要作用。

胚胎面突外胚间充质细胞的培养鉴定及向平滑肌细胞的自分化研究

目的 探讨胚胎面突外胚间充质细胞在体外的生长特性、表型特征及在无分化抑制剂 -白血病抑制因子 (L IF)的 DMEM/ F12培养基中向平滑肌细胞自分化的过程。 方法 取孕 5 0天人胚面突 ,用消化法培养获得外胚间充质细胞 ,倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况 ,免疫组织化学鉴定细胞分化表型。用无 L IF的 DMEM/ F12培养基培养 ,2天后进行抗α-平滑肌肌动蛋白 (α- SMA)单克隆抗体免疫组织化学检测 ,通过 RT- PCR在 m RNA水平检测α- SMA的表达 ,透射电镜观察细胞超微结构。 结果 培养的细胞呈单层生长 ,成纤维状 ,长梭形 ,有 2～ 4个突起 ,抗人自然杀伤细胞标志、波形丝蛋白、S- 10 0蛋白、神经元特异性烯醇化酶、肌红蛋白及 因子染色阳性 ,抗神经胶质纤维酸性蛋白、神经纤维细丝蛋白、α- SMA、角蛋白染色阴性。去除 L IF2天后 ,抗 α- SMA免疫组织化学检测呈阳性 ,RT- PCR显示细胞在 RNA水平表达平滑肌细胞特异的 α- SMA,透射电镜可见超微结构与平滑肌细胞相类似。 结论 所获得的外胚间充质细胞具有干细胞特性。在无分化抑制剂存在时 ,面突外胚间充质细胞呈明显向平滑肌细胞的自然分化。

体外成牙环境对牙髓干细胞和外胚间充质干细胞分化的影响

目的利用牙胚细胞(TGC)作为诱导成牙环境,将牙髓干细胞(DPSC)、外胚间充质干细胞(EMSC)分别与其共培养,观察DPSC和EMSC的分化能力。方法利用出生后4 d的大鼠TGC作为诱导成牙环境,将培养的DPSC、EMSC使用BrdU标记及鉴定后与其共培养,免疫荧光双标检测标记细胞表面抗原牙本质涎蛋白(DSP)的表达和碱性磷酸酶(ALP)活性的变化,免疫组化染色鉴定及图像分析DPSC、EMSC在成牙环境中的分化能力。结果共培养7 d后,EMSC共培养组DSP阳性细胞的转化率高于DPSC共培养组(P<0.05)。免疫组化染色图像分析结果表明共培养7 d后,共培养组与TGC单独培养组差异显著(P<0.05)。共培养组3、7 d后ALP活性明显增高,EMSC共培养组较DPSC共培养组ALP活性高。结论混合培养的TGC作为诱导细胞分化的微环境与DPSC、EMSC共培养后,能够诱导细胞向成牙本质细胞分化,EMSC分化能力高于DPSC。

TGF-β、rhBMP-2体外诱导下颌突外胚间充质细胞向平滑肌细胞分化

目的 :探讨TGFβ、rhBMP - 2体外诱导外胚间充质细胞向平滑肌细胞分化的能力。 方法 :取妊娠 12 .5d胎鼠第三代下颌突外胚间充质细胞 ,分别在含 60、10 0mmol/L的TGF - β和 1.6、3 .2mmol/L的rhBMP- 2的DMEM/F12中培养。相差显微镜下观察细胞的形态变化 ,免疫组化鉴定细胞性质。结果 :培养 2d ,60pmol/L的TGF - β组细胞形态发生明显变化 ,细胞变得大而扁平 ,培养 4d ,免疫组化鉴定约 70 %的细胞分化为平滑肌细胞。rhBMP - 2组细胞形态未见明显改变 ,1.6nmol/L组免疫组化鉴定约 5 %的细胞分化为平滑肌细胞 ,未能诱导分化出神经元细胞。未加LIF的对照组细胞出现向平滑肌细胞的自然分化。结论 :TGFβ、rhBMP