KDR启动子驱动的TNFR逆转录病毒载体构建及其靶向表达

目的 :为进行TNFR的靶向基因治疗研究打基础。方法 :将人TNFR55和TNFR75基因序列分别与KDR启动子 (KDRp)及灭活自身启动子的逆转录病毒载体RV D2 99重组 ,构建RV D2 99 KDRp TNFR55及RV D2 99 KDRp TNFR75逆转录病毒载体 ,分别转染包装细胞PA31 7,获得稳定的产病毒细胞系。 结果 :获得的TN FR55和TNFR75产毒细胞系病毒滴度分别为 1× 1 0 5CFU ml和 2× 1 0 5CFU ml。感染RV D2 99 KDRP TNFR55病毒的ECV30 4细胞与TNF孵育后的培养上清 ,对L92 9细胞的细胞毒活性比相同条件下的NIH3T3细胞低约2 6倍 ,而感染RV TNFR55病毒的ECV 30 4与相同条件下的NIH3T3细胞无明显差异。结论 :建立了TNFR55和TNFR75逆转录病毒高产毒细胞系 ,构建的RV D2 99 KDRP TNFR55和RV D2 99 KDRP

逆转录病毒靶向介导HDV核酶体外抑制HBV表达

目的包装携带HDV核酶的肝细胞靶向性逆转录病毒载体,并检测体外HDV核酶对乙型肝炎病毒表达的影响。方法采用脂质体法,分别包装出携带针对HBV不同基因组区域的HDV核酶的肝细胞靶向性重组逆转录病毒,感染HepG2215细胞,ELISA及荧光定量PCR检测HDV核酶对乙型肝炎病毒表达的抑制作用。结果pMSCV-U6-PreS2-Rz和pM-SCV-U6-C-Rz对乙型肝炎病毒表面抗原抑制率明显高于其他HDV核酶和对照组,分别达80%和85%,且高于脂质体转染介导的同种核酶对乙型肝炎病毒表面抗原表达的抑制率。结论靶向性重组逆转录病毒能够携带HDV核酶进入HepG2215细胞,并且对乙型肝炎病毒的表达有较高的抑制作用,为抗病毒治疗的研究奠定了基础。

端粒酶逆转录酶启动子hTERT/U6嵌合启动子的siRNA表达载体的肿瘤靶向性分析

目的:体外研究siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1表达载体在肿瘤细胞中的靶向性.方法:常规培养稳定表达绿色荧光蛋白的肝癌SMMC-7721细胞株(EGFP-7721)和稳定表达绿色荧光蛋白的人正常成纤维细胞株HELF(EGFP-HELF).以PTZU6+1质粒转染EGFP-7721细胞和EGFP-HELF细胞为空白质粒组,siRNA-EGFP-PTZU6+1质粒转染EGFP-7721细胞和EGFP-HELF细胞为实验对照组,将siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1质粒转染EGFP-7721细胞和EG-FP-HELF细胞作为实验组,用real-time SYBR Green PCR和Western Blot鉴定siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1对两种细胞株的绿色荧光蛋白表达的影响.结果:正向和反向的重组质粒siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1转染EGFP-HELF细胞与空白质粒比较,EGFP基因表达无差异(P>0.05),而转染稳定表达绿色荧光蛋白的7721后仅反向的siRNA-EG-FP-hTERT/U6-PTZU6+1重组质粒抑制EGFP基因的表达(P<0.01).siRNA-EGFP-PTZU6+1质粒与空白质粒组比较,在EGFP-7721和EGFP-HELF细胞株间,EGFP基因的表达均具有统计学差异(P<0.01).结论:反向插入的siRNA-EGFP-hTERT/U6-PTZU6+1重组质粒在肿瘤细胞具有一定靶向性,为进一步探讨基因的靶向治疗奠定了基础.

逆转录病毒载体LN.ALBTRS.TK体外靶向表达研究

逆转录 HSV-TK 载体用于肝癌的转基因治疗已在动物实验证明有良好效果,但目前尚无满意的靶向表达载体可供使用,本研究采用 PCR、Southern blot 及 Northern blot 等方法,对本室构建的逆转录载体 LN.ALBTRS.TK 在体外对多种靶细胞进行转染和表达的检测,结果表明:LN.ALBTRS.TK 能转染多种肿瘤细胞,包括肝癌细胞及非肝癌细胞,并在表达白蛋白的肝癌细胞中可检测到 mRNA 的转录和HSV-TK 的表达产物,而在不表达白蛋白的非肝癌细胞中元 HSV-TK 的 mRNA 转录和 HSV-TK 的蛋白产物表达。这一结果表明:LN.ALB-TRS.TK 逆转录载体能正确的在期望的细胞中靶向表达,具备一定的组织特异性。

靶向表达的逆转录病毒载体LN.ALBTRS.TK的构建

目的:构建出在肝细胞中具靶向表达潜能的逆转录 TK 基因载体。方法:用 p2335A-1中的一段2.0Kb的人白蛋白组织特异性转录调节序列(ALBTRS)取代 pSTK 中的 SV40启动子,所构建的载体命名为 LN.ALB-TRS.TK。结果:载体 LN.ALBTRS.TK 的结构中,含有 ALBTRS 启动子,具有在肝细胞中特异表达白蛋白的潜能,载体经酶切鉴定表明结构符合要求。结论:成功地构建出具靶向表达潜能的逆转录载体 LN.ALBTRS.TK。

靶向表达的逆转录病毒载体LN.ALBTRS.TK的构建

目的构建出在肝细胞中具靶向表达潜能的逆转录TK基因载体。方法用p2335A-1中的一段2.0kb的人白蛋白组织特异性转录调节序列(ALBTRS)取代pSTK中的SV40启动子,所构建的载体命名为LN.ALBTRS.TK。结果载体LN.ALBTRS.TK的结构中,含有ALBTRS启动子,具有在表达白蛋白的肝细胞中特异表达的潜能,载体经酶切鉴定表明结构符合要求。结论成功地构建出具靶向表达潜能的逆转录载体LN.ALBTRS.TK。

逆转录病毒载体LN.ALBTRS.TK体外转染伍用GCV对人肝癌细胞的体外杀伤研究

HSV—TK转基因治疗肝癌的效果取决于受转染的肝癌靶细胞是否对GCV敏感及其敏感的程度，体外研究的报道表明转染细胞对GCV的敏感性较未转染细胞增加100～1000倍以上，我们应用存活率曲线对LN．ALBTRS．TK转染的肝癌细胞进行研究，结果报告如下：

逆转录病毒类载体在基因治疗中的发展和应用

在当前的基因治疗临床实验中,最常用的基因运载体是经过人工改建的、携带有正常人类 DNA的病毒,通过感染的方式包裹和运送基因到人类细胞中。其中,逆转录病毒类载体无论是在应用广 度和研究深度上都远超过其他病毒。这主要是因为与其他病毒相比,逆转录病毒的免疫原性低,感染效 率高,整合性强,外源基因表达效率高,并且病毒本身具有一定的靶向性。本文将就逆转录病毒类载体 的特点、应用和目前研究的重点做一简要综述。

新型靶向性非病毒载体K16GRGDSPC转染骨髓基质细胞的条件优化

目的 优化新型靶向性非病毒基因载体——含RGD肽K16GRGDSPC介导转化生长因子β1（TGF-β1）基因转染骨髓基质细胞的转染条件。方法 固相合成法合成K16GRGDSPC寡肽并用质谱仪和高压液相色谱仪进行检测。在保持其它因素一致的条件下，通过变化单一因子来筛选某个最佳参数。结果 合成肽与设计肽的分子量一致，纯度为94％～95％，满足实验要求。在寡肽载体介导转染的过程中，溶酶体抑制剂氯喹起着不可或缺的作用，而且在氯喹溶液中的暴露时间至少应维持在8h以上；在载体／DNA复合物中暴露时间过短（〈4h）或过长（〉24h）对转染都有不利影响；血清对载体／DNA复合物与细胞的结合有明显抑制作用；质粒含量在2～4μg时转染效果最佳；质粒／载体质量比为1：2～1：4时有较高的转染效率；加入转铁蛋白也能显著提高基因的转染和表达，且在25μg时转染效率达到最大。结论 通过优化转染条件可提高寡肽载体的转染效率，可为下一步进行骨基质材料表面基因修饰研究提供基础。

作为基因转移载体的乙型肝炎病毒衣壳对肝癌细胞的靶向性

目的:探讨乙型肝炎病毒衣壳作为基因转移载体对肝癌细胞的靶向性和有效性。方法:采用PEG8000病毒浓缩法、β-丙内脂法从能持续产生HBV的HepG2.2.15细胞上清液中制备乙型肝炎病毒衣壳(hepatitisBvirusenvelope,HBVE),用它包裹绿色荧光蛋白质粒(pIRS2-EGFP)后得到基因转移载体复合物HBVE-GFP,用脂质体包裹pIRS2-EGFP后得到基因转移载体复合物Liposome-GFP。用HBVE-GFP及作为对照的Liposome-GFP转染人成肝细胞瘤HepG2细胞来研究其转导效率;用HBVE-GFP分别转染HepG2细胞及作为对照的人肺腺癌细胞A549、人宫颈癌细胞HeLa、人皮肤成纤维细胞FB来研究其靶向性;荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,流式细胞术检测细胞发光率。结果:(1)有效性检测:Liposome-GFP组及HBVE-GFP组均可见绿色荧光蛋白的表达,HBVE-GFP组的荧光强度较Liposome-GFP组更强(P<0.01);Liposome-GFP组的转染效率为(49.97±2.37)%,而HBVE-GFP组为(70.65±3.15)%,两者差异显著(P<0.01)。(2)靶向性检测:各种细胞均可见绿色荧光蛋白的表达,HepG2细胞较其他细胞具有更强的荧光强度(P<0.01),HepG2细胞的转染效率为(71.35±0·03)%,显著高于其他3组(P<0.01)。结论:乙型肝炎病毒衣壳作为基因转移载体对肝癌细胞具有较好的转染有效性和靶向性。

腺病毒载体的安全性和靶向性

腺病毒载体是基因治疗的极具潜力的载体系统,其安全性和靶向性是影响其临床应用的关键问题。本文就这两个问题的新进展作一综述。

感染靶向性重组腺相关病毒载体在基因治疗中的研究进展

重组腺相关病毒(rAAV)是一种非常有希望的人体细胞基因治疗载体。它既可以转染分裂细胞又可以转染非分裂细胞。rAAV在宿主体内以定向整合的方式存在。AAV重组体在细胞内能长期稳定地表达,且在体内不引起明显的病理变化,然而它广泛的宿主范围是体内基因治疗的一个缺点,因为它不具备组织特异性或器官局限性转导能力从而难以增加其在基因治疗中的安全性和效率。因此,开发具有组织或器官靶向性的重组腺相关载体是腺相关病毒载体发展的方向。本文就近年来感染靶向性腺相关病毒在基因治疗中的进展作一综述。

乙肝病毒衣壳作为肝癌基因转移载体对肝癌是否有靶向性

背景与目的：乙型肝炎病毒（HBV）具有嗜肝性的主要原因在于病毒衣壳（HBVE）上镶嵌的外衣壳蛋白PreS1,利用此生物特性有可能将HBVE改造成肝癌靶向性基因转移载体.本研究探讨乙型肝炎病毒衣壳作为基因转移载体对肝癌是否有靶向性.方法：采用PEG 8000病毒浓缩法、β-丙内脂法从Hep G 2.2.15细胞上清液中制备乙型肝炎病毒衣壳（HBVE）,用它包裹绿色荧光蛋白质粒（pIRS2-EGFP）后得到基因转移载体复合物HBVE-GFP,用HBVE-GFP分别转染Hep G2、A549、HeLa、FB细胞,通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,通过流式细胞仪检测细胞发光率.结果：荧光显微镜下观察可见,各组均可见绿色荧光蛋白的表达,Hep G2组较之其他3组具有更高的荧光强度;流式细胞仪检测结果显示,Hep G2组的转染效率为（71.35±0.03）%,显著高于其他3组（P＜0.001）,且其荧光强度是其他3组的3～4倍（P＜0.001）.结论：乙型肝炎病毒衣壳作为载体对肝癌具有较好的靶向性.

重组腺病毒载体靶向性策略的研究进展

近年来，研究者致力于突破基因治疗的瓶颈，极大推动了基因治疗的发展。载体系统是基因治疗的基础，截止2013年7月，在“Gene Therapy Clinical Trial Worldwide”网站登记注册的基因治疗方案中，重组腺病毒载体占476项（23.5%）。在6个亚群（A-F）、50多种血清型的腺病毒载体中，5型腺病毒（adenovirus type 5，Ad5）可特异性识别并结合多种正常组织高表达的柯萨奇病毒-腺病毒受体（coxsackie-adenovirus receptor，CAR）从而进入细胞发挥作用，基因转导效率高，因此，Ad5是目前应用最广泛的腺病毒载体。

靶向性非病毒载体GE7系统治疗人脑胶质瘤的体内外研究

目的 :研究EGF R介导的靶向性非病毒载体GE7系统治疗人脑胶质瘤的体内外效应。方法 :组建GE7基因转移系统 ,分别与 β gal报道基因、p2 1WAF 1 CIP1 基因组成复合物 ,体外转导U2 5 1MG细胞 ,分析GE7系统导入效率 ;MTS法观察细胞生长曲线 ;FACS分析细胞周期变化。建立裸鼠皮下荷瘤模型 ,分别经瘤内和尾静脉注射导入DNA载体复合物 ,观察肿瘤生长抑制率。结果 :GE7系统体外导入率最高达 70 % ,细胞生长曲线呈低平型 ,细胞周期阻滞于G1 期 ,平均凋亡指数为 2 5 .2 % ;瘤内注射和尾静脉注射抑瘤率分别为 5 6.5 %和 60 .2 %。结论 :GE7系统具有较高效率和靶向性 ,经肿瘤局部和全身途径导入p2 1WAF 1 CIP1 基因 ,均可诱导凋亡 。

靶向性非病毒载体GE7系统的构建及对人脑胶质瘤体外转移效率分析

目的：组建表皮生长因子受体介导的靶向性非病毒载体GE7系统，研究GE7系统对U251人恶性胶质瘤细胞株的体外转导效率。方法：应用上海市肿瘤研究所组建的EGF-R配体16肽GE7、流感病毒血凝素N端20肽HA20与多聚赖氨酸P.L.组成非病毒载体基因转移系统，分别与β-gal报道基因、p21WAF-1/CIP1基因组成多肽/DNA载体四元复合物。β-gal报道基因体外转导U251细胞，分析GE7系统体外导入效率。结果：载体DNA复合物组转染后24h即可观察到少量外源基因的表达，72h外源基因表达达到高峰，然后逐渐下降，转染后168h基本消失。单纯质粒DNA组仅见微弱外源基因的转入；对照组未见外源基因的转入。结论：GE7基因转移系统具有较高的基因转移效率和靶向性，为脑胶质瘤基因治疗提供了一种新的途径。

腺病毒介导的LacZ基因靶向性导入脊髓及示踪周围神经的动态过程

目的 由损伤的周围神经靶向性导入腺病毒介导的 L ac Z基因 (Ad L ac Z)至脊髓 ,动态观察病毒载体逆行输送到脊髓前角运动神经元、脊髓后根神经节 (dorsal root ganglia,DRGs)感觉神经元及基因产物顺行标记周围神经的全过程和特点。 方法 分别将 Ad L ac Z转染大鼠正中神经和胫神经近断端 ,然后以 10 - 0无创线吻合神经。在转染后 9周内的 2 4个不同时间点取出正中神经组的 C5～ T1 脊髓节段、DRGs连同臂丛 ,胫神经组的 L2 ～ L6 脊髓节段、DRGs连同骶丛。将脊髓和 DRGs的 5 0 μm横切片行 X- gal染色和免疫组织化学染色 ,臂丛和骶丛的整个标本分别行 X- gal染色。计数阳性脊髓前角运动神经元、DRGs神经元及周围神经轴突数 ,研究转基因表达在脊髓前角运动神经元、DRGs神经元及正中神经、胫神经的最早时间、高峰时间和持续时间。 结果 L ac Z基因能特异性、高效表达在损伤周围神经的感觉和运动神经元。转基因在脊髓和周围神经的表达严格限于感染神经的同侧。正中神经组标本各部位的转基因表达均早于胫神经组。胫神经组被标记的运动神经元和感觉神经元数均高于正中神经组。表达持续的时间在运动神经元最短 ,然后是感觉神经元 ,在周围神经持续时间最长。在同一组内 ,转基因表达在 DRGs神经元最早 。

肝细胞靶向性系统表达载体的构建

在肝脏疾病的基因治疗过程中,为把目的基因定向导入靶细胞,构建了具有靶向性的逆转录病毒的包装细胞,即应用RT-PCR方法分别反转录并扩增env、pres2基因,将它们分别克隆至pGEM-T载体上,经测序正确后,将一目的基因亚克隆在pcDNA3.1(-)表达载体上,然后将另一目的片段从T载体上切下,克隆至经同样酶切的重组表达载体中。从而成功地构建了肝细胞靶向性系统的表达载体pcDNA3.1(-)-env-pres2和pcDNA3.1(-)-pres2-env。

非病毒靶向载体递送小干扰RNA的研究进展

近年来由小干扰RNA(siRNA)所介导的RNA干扰(RNAi)技术发展迅速,如何高效、安全地将siRNA转运至靶组织是决定这一技术应用前景的关键问题。本文重点围绕构建siRNA的非病毒靶向载体递送系统的研究进展进行综述。

靶向性腺病毒研究进展

腺病毒作为一种重要的基因转移载体,在应用中存在着靶向性差的问题。本文从感染机制入手,改造腺病毒衣壳蛋白,使其专一地靶向目的细胞上的受体,综述了腺病毒的感染水平,目前的靶向性研究进展。