靶向二代测序在儿童社区获得性肺炎中的诊断价值

目的 分析靶向二代测序(tNGS)在儿童社区获得性肺炎中的诊断价值,为临床治疗提供参考。方法 选取2022年2月至2024年2月张家港市第一人民医院收治的90例须行支气管镜下肺泡灌洗术的儿童社区获得性肺炎患儿的临床资料,进行回顾性分析。所有患儿均接受tNGS和传统病原体检测,以传统病原体检测为金标准,比较tNGS与传统病原体检测结果的一致性,分析tNGS在儿童社区获得性肺炎中的诊断价值。结果 传统病原体检测结果显示:阳性67例,阴性23例;tNGS结果显示:阳性66例,阴性24例。tNGS诊断儿童社区获得性肺炎的敏感度为92.54%,特异度为82.61%,准确度为90.00%,阳性预测值为93.94%,阴性预测值为79.17%,与传统病原体检测结果一致性较好(Kappa值=0.882)。依据传统病原体检测病原微生物类型结果,tNGS检测病原微生物类型的检出准确率分别为人巨细胞病毒100.00%、细环病毒100.00%、肺炎链球菌90.00%、嗜血杆菌91.67%、肺炎克雷伯菌93.75%、大肠埃希菌83.33%、铜绿假单胞菌93.75%,tNGS检测病原微生物类型整体检出准确率较高。结论 tNGS诊断儿童社区获得性肺炎及病原微生物类型类型检出率较高,可用于儿童社区获得性肺炎的诊断。

靶向二代基因测序协助诊治军团菌肺炎1例

报道来自天津医科大学朱宪彝纪念医院重症医学科的1例老年男性患者,既往有慢性阻塞性肺疾病(简称慢阻肺)、冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)、陈旧性心肌梗死及心功能不全病史,本次主因“咳嗽喘憋2 d”于2023年8月26日入院。入院初步诊断考虑重症肺炎等,入院伊始予以经验性抗感染治疗,但效果欠佳,患者病情恶化,需气管插管和机械通气。完善常规相关微生物化验,无明显阳性结果,因此笔者及时进行肺泡灌洗液的靶向二代测序(targeted next-generation gene sequencing,tNGS),并在第一时间确诊为嗜肺军团菌肺炎,随后采用莫西沙星进行抗军团菌针对性治疗,患者最终痊愈。目前军团菌的分离培养阳性结果仍是诊断军团菌感染的金标准,但军团菌的生长条件苛刻,且培养步骤烦琐、周期长,往往难以获得阳性结果。在本例中,常规病原学检测未能提供关键线索,笔者依据经验性判断,并及时运用tNGS技术,最终得以明确诊断,使患者得到及时、准确、有效的诊治,最终病情转危为安。tNGS技术是临床医生诊断治疗感染性疾病的又一有效利器。

靶向二代测序在骨髓增生异常综合征患者中的诊断及预后意义

目的探讨靶向二代测序(next-generation sequencing,NGS)在骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)患者中的诊断及预后意义。方法回顾性分析淮安市第一人民医院血液科2018年1月—2021年9月收治的205例疑诊MDS的血细胞减少患者的靶向NGS数据资料,观察患者的诊断分布、髓系克隆性疾病患者的基因突变特点;采用ROC曲线分析基因突变数目及等位基因变异频率(variant allele fraction,VAF)预测MDS和MDS/MPN的诊断潜能;并采用Kaplan-Meier生存分析法研究突变数目和VAF在初诊MDS患者中的预后意义。结果205例患者包括40例意义未明的特发性血细胞减少症(idiopathic cytopenia of undetermined significance,ICUS)、47例再生障碍性贫血(aplastic anemia,AA)、23例意义未明的克隆性血细胞减少症(clonal cytopenias of undetermined significance,CCUS)、79例MDS、13例骨髓增生异常-骨髓增殖性肿瘤(myelodysplastic/myeloproliferative neoplasms,MDS/MPN)和3例MPN患者。其中,以髓系克隆造血为表现的MDS/MPN、MDS和CCUS 3组患者的VAF的平均值分别为45.12%(7.90%~93.60%)、44.79%(8.70%~99.70%)和34.83%(4.40%~94.60%)(P=0.1778);3组突变数目的平均值分别为2.462(0~7)、1.886(0~7)和1.826(1~4)(P=0.4593)。诊断方面:VAF预测MDS及MDS/MPN的敏感度为78.9%,特异度为80.0%,最佳截断值=6.6%;基因突变数目的敏感度为78.9%,特异度为78.2%,最佳截断值=1;然而2个指标联合并不能提高MDS及MDS/MPN的诊断效能。MDS预后方面:VAF≥57.93%组(n=13)患者较VAF<57.93%组(n=66)的患者预后更差;中位OS显著缩短(9.0个月vs未达到,P=0.0005);中位PFS也显著缩短(11.0个月vs未达到,P=0.0079)。基因突变数目≥2(n=42)的患者较突变数目<2(n=37)的患者预后差;中位OS显著缩短(33.0个月vs未达到,P=0.0265);而中位PFS差异无统计学意义(P=0.6067)。结论本研究的靶向NGS谱简洁实用,基因突变数目和VAF对MDS患者的诊断预测和预后判断具有重要的临床意义。

病原靶向二代测序在下呼吸道感染病原体诊断中应用价值研究进展

下呼吸道感染(LRTI)病原体复杂,对婴幼儿和老年人的健康产生严重威胁,早期明确病原体诊断是有效治疗的关键。传统LRTI诊断方法存在一定局限,包括低灵敏度、标本低特异度、周转时间较长,以及无法在单一标本中同时检测多种病原体,临床上迫切需要更精准的病原体检测技术。病原靶向二代测序(tNGS)不依赖传统微生物培养,将多重聚合酶链反应(PCR)和tNGS巧妙结合,采用多重PCR正向富集靶向病原体,提高检测的灵敏度,同时排除宿主核酸的影响,实现不同器官感染、不同标本类型等关键病原体的鉴定。该文对近年来国内外关于tNGS在LRTI病原体鉴定中的应用作一综述,分析其在不同病原体中的检测效能、优势及局限性,以确保tNGS在临床诊断中能够得到适当应用。

基于二代测序技术探究葛根素治疗酒精性肝炎的潜在分子靶点

目的基于二代测序技术筛选葛根素作用于酒精性肝炎(AH)的潜在药物靶点和信号通路,探讨葛根素的作用机制。方法将8周龄健康雄性C57BL/6小鼠9只随机均分为对照组、AH组(构建AH小鼠)、葛根素组(构建AH小鼠并葛根素处理)。检测各组小鼠肝功能指标。HE染色及油红O染色评估肝脏组织活动性及脂肪变性。基于二代测序技术对AH组及葛根素组进行转录组测序,采用Trimmomatic软件获取质控数据和edgeR软件识别组间差异表达基因。利用KOBAS软件进行GO分析和KEGG分析。结果与AH组比较,葛根素组转氨酶明显降低,肝组织炎症评分及脂肪变性评分均明显下降。二代测序结果显示,AH组、葛根素组分别平均获得55601831个和52934410个校正后短测序片段,共筛出790个GO成功注释(生物过程574个,分子功能141个,细胞成分64个)。两组间差异表达基因上调178个,下调258个,主要富集于有机酸代谢、细胞骨架的结构组成、微管。KEGG通路富集分析显示45条通路。结论葛根素治疗酒精性肝炎的作用靶点功能富集在有机酸代谢、细胞骨架的结构组成、微管;可能通过氨基酸代谢通路起到治疗作用。

利用目标基因捕获结合二代测序技术发现左心室心肌致密化不全MYBPC3基因错义突变

目的:建立目标基因捕获结合第二代测序技术,对孤立性左心室心肌致密化不全(IVNC)患者的已知致病基因MYBPC3进行突变筛查。方法:收集5例IVNC患者及一级亲属的超声影像学资料,并提取外周血全基因组DNA,设计MYBPC3外显子区域特异性捕获探针,与基因组DNA文库进行杂交,富集目标基因组区域DNA片段,利用二代测序技术,确定突变位点,并使用Sanger测序法在其一代亲属中验证。结果:目标基因特异性捕获探针可有效地捕捉并富集基因组DNA目标靶片段。在5例IVNC患者中,发现1例MYBPC3基因杂合非同义突变c.G1000A(p.E334K),该突变位于MYBPC3基因第13外显子中,测序深度249.65。经过数据分析与Sanger测序验证后,父亲发现此突变位点,母亲未发现提示突变的父亲的遗传。结论:本研究所建立的Gen Cap目标基因捕获测序技术结合二代测序技术成功发现了MYBPC3基因突变。

ABO血型基因分型中靶向捕获二代测序技术的建立

目的建立以多重PCR捕获为基础的ABO血型基因二代测序(next-generation sequencing,NGS)分型技术,结合血清学鉴定技术,对ABO血型准确定型。方法开发用于ABO血型的多重PCR捕获的NGS技术,靶向捕获ABO基因全序列建立DNA文库,利用Illumina NGS平台对20例深圳市血液中心健康无偿献血者血液标本做ABO基因测序分型;同时用血型血清学方法、PCR-SSP基因分型方法、以及第6、7外显子Sanger测序对同一批标本做ABO血型鉴定,以验证这种NGS技术做ABO血型鉴定的准确性。结果 1)利用新建立的靶向捕获二代测序技术对20例健康无偿献血者血液标本ABO基因的测序分析:平均测序深度为4 667±893,特异性与均一性分别为92.59%和92.47%,测序深度>20覆盖度为98.25%,均得到了唯一的分型结果。2)新建立的靶向捕获二代测序技术对于20例标本做的ABO全基因测序分型所得结果与血清学鉴定方法和基因分型技术的结果相符。结论成功建立了ABO基因多重PCR靶向捕获NGS测序技术,可以满足ABO血型的鉴定要求。

应用目标基因捕获结合二代测序技术检测无遗传性眼病家族史的遗传性视网膜疾病患者的致病基因

背景遗传性视网膜疾病（HRDs）是以原发性视网膜病变为主要病理改变、视力和色觉等视敏度严重损害为主要临床表现的致盲眼病，其与遗传因素密切相关，是『晦床上难治性盲的首要原因。目的应用目标基因捕获结合二代测序技术检测HRDs的致病基因。方法选择2014年1月至2015年1月在宁夏眼科医院就诊的无遗传性眼病家族史的20例HRDs患者作为研究对象。收集所有患者及其家庭成员临床资料，完善眼科检查，抽取患者和家庭正常成员外周静脉血，提取DNA。针对232个HRDs已知致病基因的目标序列设计并定制目标序列捕获芯片，借助高通量二代测序技术检测患者的遗传变异，数据经分析滤过，候选突变进行Sanger测序验证和致病性评估，明确致病基因和突变，并对表型和基因型间的关系进行分析。结果20例HRDs患者中有11例患者检测到致病性突变位点，共涉及9个基因，阳性率为55％。其中有8例患者检测到复合杂合突变，3例患者为纯合子突变，均为新发现的突变位点。通过对家系成员的基因筛查分析，6例HRDs患者为常染色体隐性遗传，5例遗传类型不确定。结合临床表型以及基因检测结果分析，11例HRDs患者的诊断分别为锥杆细胞营养不良5例，致病基因分别为ABCA4、RPE65、USH2A、RIMSl和RHO；Leber先天性黑嚎3例，致病基因分别为CRBl（2例）和LCA5；先天性静止性夜盲1例，致病基因为PRP乃；Best卵黄样黄斑营养不良1例，致病基因为BESTl基因；Stargardt病1例，致病基因为ABCA4基因。结论目标基因捕获结合二代测序技术可以对视网膜疾病患者进行快速、有效的基因诊断，结合临床特征分析有助于提高隐性遗传及遗传方式不明的HRDs的临床诊断水平。

宏基因组二代测序拷贝数变异分析与ctDNA联合应用诊断脑转移瘤1例

报告1例68岁男性,以头晕、走路不稳起病,起初考虑脑囊虫病,送检脑脊液宏基因组二代测序技术(metagenome next-generation sequencing,mNGS)未检测到脑囊虫,但检测到染色体发生重复改变,表明存在恶性肿瘤DNA,进一步利用循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)协助诊断为表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)阳性非小细胞肺癌脑转移瘤。我们联合应用mNGS双组学检测及ctDNA检测,结合全身PET-CT检查,成功诊断了1例脑转移瘤,并指导临床行肿瘤靶向治疗,患者症状明显好转,脑转移瘤数量明显减少。此技术为患者提供了一种新的非侵入性的肿瘤诊断方法,本病例为探索脑脊液mNGS双组学检测提供了参考案例。

芯片捕获二代测序技术在新生儿疾病筛查中的应用

目的探讨芯片捕获二代测序技术在新生儿疾病筛查中的临床应用价值。方法收集新生儿遗传代谢病筛查干血滤纸片样本,采用芯片捕获二代测序技术对169种常见疾病致病基因的已报道致病位点进行检测,检出位点采用Sanger测序验证。结果150例样本中有4例为可疑阳性患者(阳性率为2.67%),88例为致病基因携带者(携带率为58.67%),58例未检测到致病基因变异。其中,携带1个致病基因变异的样本高达40.7%,最多可见携带4个不同的致病基因变异。携带频率最高的致病基因为GJB2和SLC26A4,其次为PAH、SLC22A5、DUOX2、SLC12A3、USH2A及ACADS。结论基于芯片捕获二代测序技术的新生儿疾病筛查扩大了筛查病种,与传统生化筛查结果进行结合和分析,可有效降低筛查假阳性率,提高阳性预测值,具有重要的临床价值。

二代测序技术在肿瘤治疗中的应用进展

随着基因测序技术的进步,人们对肿瘤基因组学的认识不断深入,逐步形成以生物信息大数据和个体化治疗相结合的肿瘤诊治模式。二代测序技术(NGS)的出现,因其高通量、高灵敏等优势,在肿瘤发病机制的研究、生物学分型,以及临床诊断和治疗中的应用都取得显著成果。该文将对二代测序技术在常见恶性肿瘤治疗中的应用进展进行综述。

基于多重PCR靶向二代测序的近交系小鼠遗传质量监测方法建立

目的建立基于多重PCR靶向二代测序的小鼠遗传质量监测方案。方法从小鼠单核苷酸多态性(SNP)数据库筛选出相对均匀分布在20条染色体上的112个SNP位点,然后对SNP位点附近片段进行多重PCR扩增,建库后进行Illumina高通量测序,对原始测序数据进行生物信息学分析获得SNP信息。结果测序结果显示,多重PCR的扩增子均一性好,各片段成功率高达90%以上,特异性高,高深度测序条件下, SNP位点的等位基因比例趋近于1或0,符合纯合子条件;分析4批近交系小鼠样本,表明SNP位点成功鉴定的比例分别为99.82%, 92.00%, 99.10%和90.35%,且所有小鼠品系个体的SNP位点均为纯合,并被成功确定为目标品系;品系间两两比较,最大差异数为73个,最小差异数为3个,差异位点平均数为53个,差异中位数为60个,显示出本方案对常见近交系小鼠品系分辨率较高。结论多重PCR靶向二代测序方案的SNP分型方案是一种准确、快速、高效的基因分型方案,可用于遗传质量检测和品系鉴定。

二代测序对比增强免疫组化检测非小细胞肺癌ROS1基因探索

目的:比较增强免疫组化(Ventana immunohistochemistry,Ventana IHC)检测非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)C-ros原癌基因1-受体酪氨酸激酶(C-ros oncogene 1 receptor tyrosine kinase,ROS1)蛋白表达和二代测序(next-generation sequencing,NGS)技术检测ROS1基因融合突变的一致性。方法:应用NGS技术在DNA层面检测966例NSCLC患者标本ROS1基因融合突变情况,同时应用Ventana IHC检测其中732例标本ROS1蛋白的表达情况。结果:NGS检测结果显示966例NSCLC患者的ROS1基因融合突变率为1.0%(10/966),阳性样本病理类型为肺腺癌。Ventana IHC检测结果显示ROS1蛋白表达阳性率为17.6%(129/732),阳性样本病理类型主要为肺腺癌。Ventana IHC和NGS两种方法检测结果的一致性为83.6%(612/732),kappa=0.110(P<0.001)。两种方法检测ROS1基因差异具有统计学意义(P<0.001)。结论:作为ROS1基因的检测方法,Ventana IHC法比NGS法更灵敏,两种方法检测结果的一致性较差,两者差异具有统计学意义。Ventana IHC筛查出ROS1阳性样本,可采用NGS进行验证。

二代测序技术在骨与软组织肿瘤研究中的应用

近年来,测序技术在肿瘤研究及治疗中应用越来越多,采用该方法可以对肿瘤进行分子特征分析,并试图通过这一过程寻找针对性更强,存在潜在治疗收益的药物,以提高肿瘤治疗效果,特别是对于常规治疗失败的肿瘤。这种方法在一些肿瘤如肺癌、乳腺癌、结直肠癌等领域取得了一些突破性进展,但在异质性很强的肉瘤治疗中,目前尚未得到令人满意的结果,然而对于骨与软组织肿瘤,分子水平检测能否反映出肿瘤生物行为特性,判断预后,指导治疗有待进一步研究。本文旨在通过回顾文献明确二代测序技术在骨与软组织肿瘤基础研究及临床治疗方面的应用现状。

基于二代测序的子宫内膜癌患者基因突变分析

目的探讨淮安地区子宫内膜癌人群的基因遗传信息。方法于淮安市妇幼保健院行手术治疗的子宫内膜癌患者15例入组,抽取患者静脉血5 ml,通过二代基因测序技术,共检测110个基因位点,分析该组患者基因突变信息。结果15例患者中共检测出75个基因突变,结合TGCA数据库分析,发现21个有义突变,其中ATM、MSH2、PIK3R1、PTEN、TET2和TSC1为抑癌基因,ALK、CTNNB1、ERBB2、FGFR2、HNF1A、KIT、MTOR、PDGFRA、PPP2R1A和SF3B1为癌基因。PTEN基因的突变率最高(46.67%),PIK3R1、AKT2和FOXO1基因的突变率位于PTEN基因之后,且与子宫内膜癌的发生发展相关。结论通过二代基因测序技术可以明确子宫内膜癌的遗传突变情况,进一步明确其可能存在的分子机制,为临床开发新的治疗靶点提供理论依据。

用于高通量测序的基因组靶序列捕获方法的建立

文章旨在建立一种基因组目标靶序列捕捉文库的方法,并结合第二代测序技术,以实现候选基因区段的深度测序。利用Agilent公司的eArray在线平台,对1250个基因的11824个外显子共2414977bp的基因组序列进行120个碱基长度的捕捉探针(钓饵)设计,并制备成SureSelect液相靶序列捕获试剂。选用2例人基因组DNA,超声打断后末端补平并磷酸化,连接SOLiD接头,回收150bp～200bp的DNA片段,与靶序列探针杂交捕获目标序列,油包水微乳滴PCR扩增后,磁珠分离富集,上SOLiD测序系统通过工作流程分析(WFA)进行文库质量的评价,或正式测序反应。结果显示对所包含的11147个基因外显子片段设计出并合成了46509个捕捉探针,制备成SureSelect试剂盒。探针可有效地捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段,定量PCR显示富集效率可达29倍。WFA分析表明文库可以在SOLiD仪器进行正式测序。测序结果显示靶序列区域的测序数占有效总测序数的比例达到70%,覆盖率均在200×以上。结果表明本研究所建立的SureSelect基因组靶序列捕捉、富集建立测序文库的技术路线可行,可直接用于SOLiD测序仪的测序。

多倍体同源区段二代测序生物信息学分析关键参数优化

【目的】多倍体植物同源区段单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)标记分型挑战颇大。本研究以四倍体陆地棉同源区段聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)靶向扩增子数据集为例,观测同源区段的影响并优化生物信息学分析方案。【方法】首先扩增并测序获得136个陆地棉样本DNA的包含潜在变异的3个区段,其次使用不同参数进行比对与SNP检出,最后比较优化不同方案分析结果的异同。【结果】常规分析发现,区段1的3个SNP位点和区段2的1个SNP位点在样本中均鉴定为野生型或纯合突变型,而几乎所有样本的区段3鉴定为杂合突变型。Blast分析表明,位于A12染色体的区段3与其同源序列(位于D12染色体)相似性为96.28%。仅将区段3的同源序列作为参考序列分析,潜在SNP位点的基因型鉴定结果无变化;而将区段3与其同源序列同时作为参考序列分析,比对到区段3与其同源序列的读长的比例分别为48%、52%,因此存在较多同源区段3的读长是导致分型错误的主要原因,并确定了区段3潜在SNP位点的基因型应为TT。此外,通过对比GATK结果在区段3发现了2个新SNP且排除了3个因部分同源序列变异造成的假阳性SNP。【结论】本研究验证了同源序列的存在会严重影响多倍体SNP鉴定与生物信息学分析;对关键参数优化特别是将多倍体同源序列同时作为参考序列,能够提高SNP分型的准确度。

利用二代测序技术进行近交系小鼠品系验证

为了对生产群中的无特定病原体(specific pathogen free,SPF)级近交系小鼠进行遗传质量检测,以确认其品系正确,未发生突变。选取2个品系(Balb/cByJ和C57BL/6J)雌雄各半,共16只小鼠,通过多重靶向多聚酶链反应(PCR),扩增包含112个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点的DNA片段,对其进行二代测序(next-generation sequencing,NGS),获得它们在这些SNP位点的基因型。经二代测序后,得到有效读取数为6118873,每个位点的平均读取数为3631,97个SNP位点在所有的小鼠中都被分型,另外15个SNP位点,至少在1个样本中没有被检出。其中,6个SNP只在一个品系的小鼠中有结果,还有2个SNP只在一种性别的小鼠中有结果。在所有样本中得到的全部SNP分型结果都符合其品系的基因型,且均为纯合子。送检的小鼠遗传特征稳定,利用二代测序技术进行SNP分型,能对近交系小鼠的遗传特性进行快速准确的评估。

二代测序在骨与软组织肿瘤中的应用及其研究进展

二代测序是一种可以实现快速高通量测序的技术,常用的二代测序技术包括全外显子组测序、全基因组测序和RNA测序等。在骨与软组织肿瘤领域,利用二代测序不仅可以辅助诊断临床上常规诊断方法难以鉴别的肿瘤类型,并且可以通过测序发现一些具有重要意义的肿瘤驱动基因和突变,从而有助于实现精准治疗。本文主要阐述二代测序常用技术及其特点,并就二代测序技术在骨与软组织肿瘤中的应用和研究进展进行综述。

宏基因捕获法二代测序技术在感染性胰腺坏死病原学诊断中的价值

背景与目的:早期病原学精准诊断是改善感染性胰腺坏死(IPN)患者预后的突破口之一,但目前临床上缺乏早期精准识别IPN的高效方法。本研究探讨基于宏基因捕获法(MetaCAP)的二代测序技术在IPN病原学诊断中的应用价值。方法:采用前瞻性研究方法,选取2024年1月—7月中南大学湘雅医院29例疑似急性坏死性胰腺炎患者进行血MetaCAP检测和常规病原学培养。将胰周积液病原学培养结果作为金标准,比较两种检测方法的诊断效能。结果:由于3例未获胰周积液培养结果,纳入最终分析的病例总数为26例。全组病死率为23.1%(6/26)。住院期间,确诊IPN的病例为9例(34.6%)。MetaCAP诊断IPN的敏感度和阴性预测值均明显高于常规病原学培养(77.8%vs.11.1%,P=0.031;86.7%vs.65.2%,P=0.032),而两种方法的特异度(76.5%vs.88.2%,P=0.689)和阳性预测值(63.6%vs.33.3%,P=0.347)差异无统计学意义。MetaCAP的平均检测耗时33(20~49)h,微生物培养耗时125(45~142)h,差异有统计学意义(P<0.001)。血MetaCAP检测的平均费用为2500元/例,但MetaCAP检测仅占平均住院费用的1.19%。结论:MetaCAP在IPN的早期病原学诊断中具有重要价值,且耗时较短,有较好的检验效能和卫生经济学价值,具有良好的临床应用前景。