靶向捕获高通量测序技术在检测早期乳腺癌胚系突变中的应用价值

目的应用靶向捕获高通量测序技术探究早期乳腺癌患者血浆胚系突变情况与临床病理特征的相关性。方法选取99例早期乳腺癌女性患者,采用靶向捕获高通量测序技术对其血浆标本进行21个乳腺癌易感基因测序,对检测到的突变位点进行筛选和分类,并分析其与临床病理特征的相关性。结果有48例患者检测出18个基因的55个突变位点,其中包含45个错义突变、1个无义突变、8个插入缺失突变、1个剪切位点突变。突变最多的为BRCA基因,检测出10个突变位点。55个突变位点中有9个(16.4%)为致病性突变,4个(7.3%)为无害突变,42个(76.3%)为意义未明突变;其中15个突变位点在ExAC、ClinVar、dbSNP、HGMD数据库中均未提及。统计分析结果显示,致病性胚系突变在不同年龄组和增殖细胞核抗原(Ki67)阳性与否的比较中,差异有统计学意义(P=0.044、0.024);>40岁和Ki67阳性患者发生致病性突变的概率更高。结论靶向捕获高通量测序技术应用于早期乳腺癌易感基因的筛查有一定意义,为临床个体化治疗提供了理论基础和实验依据。

肝癌细胞株-乙型肝炎病毒DNA整合事件的高通量靶向捕获测序分析

目的 采用探针捕获和高通量测序技术研究HepG2.2.15与HepAD38 2个乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)肝癌细胞系中病毒DNA在宿主基因组中的整合位点特征。方法 提取HepG2.2.15与HepAD38细胞基因组DNA,采用探针捕获和高通量测序策略对2个肝癌细胞株中整合的HBV DNA进行捕获测序,使用Trimmomatic、BBAP、BWA(Burrows-Wheeler Aligner)等生物信息学软件进行数据分析;最后通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)及克隆测序对病毒DNA整合特征进行验证。结果 利用探针捕获和高通量测序技术分别在HepG2.2.15与HepAD38细胞系中检测出12、7个HBV DNA整合事件,随机分布在chr1、chr2、chr7、chr9、chr16、chr17、chr19、chrX染色体上,整合位点上下游基因出现频率较高的有DPP7、TRIM56、GPC3等。结论 成功建立基于探针捕获和高通量测序技术检测HBV DNA在宿主基因组上的整合片段的方法,HepG2.2.15与HepAD38细胞系中HBV整合事件在染色体上随机发生,大部分整合位点发生在HBV基因组上的X基因区域。

高通量测序技术在低频突变检测中的应用

体细胞突变的累积与衰老、肿瘤及多种疾病的发生密切相关。在正常组织细胞中,基因组中自发突变和诱发突变的变异等位基因频率极低,对这类低频突变的检测一直面临挑战。第二代和第三代高通量测序(next-generation sequencing,NGS)技术的出现,可以实现任意物种全基因组上变异的直接检测,克服传统突变检测技术的诸多局限性。但是常规NGS由于测序错误率较高从而限制了其在低频突变检测上的应用,基于分子一致性测序策略进行错误矫正的高准确性NGS测序技术作为有效的低频突变检测工具,有望在环境诱变剂的评价与研究、细胞与基因治疗药物风险评估、人群健康风险监测和生命科学基础研究领域发挥重要作用。本文对比经典突变检测方法,对基于NGS的低频突变检测技术研究进展进行综述,并对应用前景进行展望,以期为该技术的进一步开发、研究和在相关领域的应用提供参考。

靶向高通量测序技术在肺炎病原学诊断中的应用进展

肺炎病原学的临床诊断方法较多,传统检测技术存在检测范围有限、准确性欠佳、耗时长等不足。宏基因组二代测序(mNGS)技术检测范围广,但属于非靶向广谱病原学筛查,价格昂贵,临床应用受限。而靶向高通量测序(tNGS)技术可实现病原光谱精准检测,且检测成本更低。通过纤维支气管抽取支气管肺泡灌洗液,能直接取样,避免标本被口咽菌群污染,提高了病原学检测的准确性。因此,采用tNGS技术检测支气管肺泡灌洗液,能显著提升肺炎病原学的诊断效果。本文对tNGS技术在肺炎病原学诊断中的应用进展进行综述,旨在分析tNGS技术在肺炎病原学诊断中的价值,为tNGS技术的临床应用提供参考。

靶向高通量测序技术(tNGS)在下呼吸道感染病原体检测中的诊断价值

目的探讨靶向高通量测序(Targeted Next-generation Sequencing,tNGS)对下呼吸道感染病原体检测的优势及指导治疗作用。方法选取2022年1月—2023年12月广西梧州人民医院收治的295例疑似下呼吸道感染患者为研究对象,所有患者均行痰或肺泡灌洗液tNGS与传统病原学检测(Traditional Pathogen Testing,CMTs),以CMTs为金标准,分析tNGS的灵敏度、准确度、特异度、阳性预测值及一致性。结果295例疑似下呼吸道感染患者的检出结果显示,tNGS检测的阳性检出结果为290例,CMTs的阳性检出结果为289例。tNGS的灵敏度为99.31%,准确度为98.98%,特异度为80.00%,阳性预测值为99.65%。kappa值为0.722,提示两种检测方法具有较高的一致性。结论tNGS技术在疑似下呼吸道感染患者中具有较高的诊断价值。

基于高通量测序技术的9种铁线莲属药材混合粉末分子鉴定

目的建立基于高通量测序技术的9种铁线莲属混合粉末分子鉴定方法。方法采用高通量测序技术,对9种铁线莲属药材混合粉末样品中的总DNA经提取,对ITS2片段进行PCR扩增,利用Illumina MiSeq平台对DNA片段进行双端测序,最后采用FLASH、QIIME、GraPhlAn及MEGA 7.0软件对序列进行整理并聚类分析,鉴定混合粉末中的物种。结果混合粉末样品中得到高质量的ITS2序列共496条,铁线莲属物种含有序列72条,比对出棉团铁线莲、女萎铁线莲、短尾铁线莲、灌木铁线莲、单叶铁线莲、黄花铁线莲、粗齿铁线莲等7个物种,未能比对出东北铁线莲和芹叶铁线莲。结论以ITS2作为DNA条形码,采用高通量测序技术,可以鉴定出铁线莲属药材混合样品中的7个物种,为混合药材的鉴定提供依据。

基于高通量测序技术对不同地区米酒曲微生物群落结构的分析

采用高通量测序技术对湖北宜昌当地传统米酒曲与广西玉林传统米酒曲中的微生物群落结构进行解析,获得了酒曲中主要微生物种属和占比。结果表明,广西米酒曲在物种丰富度以及群落多样性上均高于宜昌米酒曲;广西米酒曲中优势真菌属以根霉属(Rhizopus)、毛霉属(Mucor)、毕赤酵母属(Pichia)和假丝酵母属(Candida)为主,宜昌米酒曲中根霉属(Rhizopus)和毛霉属(Mucor)为优势菌属;在细菌属水平上,广西米酒曲以片球菌属(Pediococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、魏斯氏属(Weissella)、乳杆菌属(Lactobacillus)为主,宜昌米酒曲优势菌属为假单胞菌属(Pseudomonas)和魏斯氏属(Weissella);ASV/OTU韦恩图分析表明宜昌酒曲在物种独特性上要优于广西玉林酒曲。本研究揭示了宜昌传统米酒曲中的真菌与玉林传统米酒曲真菌菌种的差别,为逐步改善传统酒曲质量,以及相关微生物的进一步利用提供了理论指导依据。

高通量测序技术对杀菌型益生菌含乳饮料菌群结构分析

目的分析杀菌型益生菌含乳饮料中菌群组成结构,并探究宣称添加益生菌的真实性和合规性。方法本研究以高通量测序技术为基础,从市售11批次杀菌型益生菌含乳饮料中全基因组提取,进行V3/V4变异区序列的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增后,整理及统计样品测序序列数目,操作分类单元(operational taxonomic unit,OUT)归类,生成稀释曲线、Alpha多样性、聚类、丰度分布曲线与分析菌群结构和菌种标示合规性。结果共得到39231条优质序列,分布在210~518 bp范围内;共注解到16个门、37个纲、71个目、129个科、265个属;从门分类水平主要为厚壁菌门(Firmicutes 91.66%),从纲的分类水平主要为芽孢杆菌纲(Bacill 90.43%),从目的分类水平主要为乳杆菌目(Lactobacillales 82.74%);优势菌种为德氏乳杆菌保加利亚亚种、嗜热链球菌;同时产品有检出携带致病性非益生菌菌群。11种产品标签标示与实际检测到菌株完全一致的仅有1批次。结论本研究建立的高通量测序技术能准确、快速地探究杀菌型益生菌含乳饮料中微生物菌群多样性和潜在的致病性,市售产品益生菌种类丰富,但同质化程度较高,产品间菌群分布均匀度差异大。

串联质谱联合高通量测序技术在新生儿遗传代谢病(IEM)筛查诊断中的应用价值

目的:探讨串联质谱联合高通量测序技术在新生儿遗传代谢病(IEM)筛查诊断中的应用价值。方法:回顾性分析本院2023年1月至2023年10月接收的3625例接受IEM筛查的新生儿的临床资料,对IEM患儿与正常新生儿的基本资料进行比较,并分析IEM新生儿的变异情况。结果:本组新生儿中基因变异共15例;IEM患儿与正常新生儿的基本资料差异无统计学意义(P>0.05);IEM相关基因变异的15例新生儿中,ACAD8基因复合杂合变异1例,SLC22A5基因变异携带者1例,前者被诊断为异丁酰辅酶A脱氢酶缺乏症,后者被诊断为原发性肉碱缺乏症;3例SLC22A5变异新生儿的游离肉碱水平(7.80±1.26)μmol/L明显低于3622例SLC22A5未变异新生儿的游离肉碱水平(18.95±3.25)μmol/L(P<0.05);4例MCC1/MCC2变异新生儿的丁二酰肉碱+3-羟基异戊酰基碱水平(0.48±0.08)μmol/L明显高于3621例MCC1/MCC2无变异新生儿的丁二酰肉碱+3-羟基异戊酰基碱水平(0.17±0.03)μmol/L(P<0.05)。结论:新生儿IEM筛查诊断中串联质谱联合高通量测序技术可取得确切的应用效果,对于存在基因变异携带的患者,要与其临床症状结合来开展诊断工作,避免出现漏诊的情况。

基于多重长PCR靶向捕获测序技术的高同源SNP鉴定

为建立一种高同源区段的单核苷酸多态性(SNP)基因分型技术,通过构建本地Blast对SNP所在的200和400 bp区段进行同源性评估,并筛选出高同源区段的SNP。利用第一轮多重长PCR(polymerase chain reaction)捕获329个样本的9个高同源区段SNP所在的长片段,使用纯化后的第一轮PCR产物作为模板进行扩增子建库测序,检测样本共得2 928个SNP位点信息,测序成功率高达98.885 6%。利用Hardy-Weinberg(HWE)法则计算试验研究的9个高同源区段SNP位点的基因频率(p值均大于0.05,符合HWE法则),并与NCBI(national center for biotechnology information)中千人基因组数据库中获取的基因频率相比对,发现二者单碱基基因频率一致(误差限<0.15)。研究表明,利用多重长PCR靶向捕获技术结合二代测序技术为高同源区段的SNP分型提供一个准确、快速、大样本检测方案。

基于高通量测序技术老面酵头微生物菌群多样性分析

通过高通量测序技术对不同活化时间及活化次数老面酵头的微生物菌群多样性进行研究。结果表明,随着活化时间的增加,老面酵头的细菌菌群丰富度无显著变化(P>0.05),多样性呈先降低后升高的趋势,真菌菌群丰富度呈先升高后下降的趋势,多样性呈下降趋势;随着活化次数的增加,老面酵头的细菌菌群丰富度无显著变化(P>0.05),真菌菌群丰富度及细菌和真菌菌群多样性均呈下降趋势,说明活化对于老面酵头的菌群多样性具有不利的影响。不同老面酵头样品中相对丰度较高的微生物属具有一定差异。在门水平上,共检测出16个细菌门,优势细菌门分别为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidota)和变形菌门(Proteobacteria);共检测出4个真菌门,优势真菌门分别为子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)和球囊菌门(Glomeromycota)。在属水平,共检测出195个细菌属,优势细菌属分别为乳杆菌属(Lactobacillus)和魏斯氏菌属(Weissella);共检测出46个真菌属,优势真菌属分别为哈萨克斯坦酵母属(Kazachstania)、交链孢霉属(Alternaria)和曲霉属(Aspergillus)。

高通量测序技术在粪便菌群移植中的应用

粪便菌群移植(FMT)作为目前治疗肠道菌群失调最为有效的手段,在艰难梭菌感染、炎症性肠病、肠易激综合征等疾病治疗方面发挥着重要作用。目前,RBX2660、Vowst等粪便微生物药物已获得美国食品药品监督管理局批准上市。高通量测序技术作为一项飞速发展的新技术,可通过扩增肠道菌群可变区的特定区段,分析菌群的组成、丰度等信息,为FMT过程中的供体选择、受体特征分析、效果监测等环节提供强有力的工具。高通量测序技术的应用可有力推动FMT的粪便制备过程质量控制、功能微生物确定、效果监测等方面的发展。本文旨在阐述和总结高通量测序技术在FMT领域的应用前景以及未来的发展趋势。

高通量测序文库质量控制技术研究进展

作为生命科学和医学领域中的关键性支撑技术,高通量测序已得到快速发展并日趋成熟。该技术工作流程可分为核酸提取、文库构建、上机测序、数据分析等,其中文库构建是承上启下的关键步骤,文库构建的效果受制于上游样品质量,同时会对测序数据产出后的数据分析造成影响。对文库构建质量控制技术的选择和实施是提高结果可靠性、降低测序数据误差的重要保证。本文对文库构建质量控制技术进行深入综述,总结评价其原理、优缺点、适用范围,并对实际应用场景中相关技术的选择进行了论述,以期为科研人员、疾病预防控制人员等在选择文库质量控制技术时提供理论依据与参考,从而促进高通量测序工作的质量和效率。

高通量测序技术在宫颈癌早期诊断中的应用

目的探讨宫颈癌早期诊断中运用高通量测序技术的临床价值。方法选择收治的45例宫颈癌患者为研究对象,通过采集宫颈脱落细胞、提取DNA,运用高通量测序技术对宫颈脱落细胞基因组进行测序,检测PIK3CA等与宫颈癌发生相关的基因突变情况,并且结合TCGA、COSMIC数据库信息判读宫颈脱落细胞的基因突变情况。结果45例宫颈癌患者中,42例患者检出基因突变,检出率为93.33%,鉴定出的突变基因共160个,其中PIK3CA占有较高的比例,其次为RB1、AKT2以及FAT1等。宫颈癌患者的基因突变类型包括拷贝数变异、插入缺失突变、移码突变、无义突变以及错义突变等,其中比较常见的是拷贝数变异和错义突变。同时,PIK3CA基因突变与患者的分化程度有关(P<0.05),但是与有无高危型HPV感染、淋巴结转移、组织学类型、临床分期、肿瘤大小以及年龄等因素无关(P>0.05)。结论宫颈癌患者中普遍存在基因突变,主要为多基因突变,其中PIK3CA是比较常见的一种突变基因,其信号通路以PI3K-AKT信号通路为主,并且运用高通量测序技术,能够及时发现新的一些基因突变,为早期诊断宫颈癌奠定理论基础。

叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌

目的 应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应-高通量测序技术鉴定冷链食品中多种病原菌,构建病原菌分子进化树。方法 以冷链食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特氏菌5种病原菌作为研究对象,应用叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术作为冷链食品中病原菌检测初筛手段,应用微生物培养法以及生化鉴定仪器法进行方法比对与结果验证,运用高通量测序以及分子进化树构建作为冷链食品中所分离病原菌的种属地位确证方法。结果 叠氮丙啶-实时荧光聚合酶链式反应技术成功扩增了冷链食品中生活状态病原菌的特征性核酸片段,排除了死亡细菌以及阴性对照菌的干扰,病原菌检出限可达到1×10^(3)CFU/mL,一次反应可检测42份试样,可以在18 h内完成检测工作。在冷链食品中病原菌抽样检测调查中,随机采集的751份冷链食品,共检出62株病原菌,病原菌总体检出率为8.3%(62/751)。通过后续的16S rRNA测序以及葡萄球菌属、弧菌属以及李斯特菌属分子进化树的构建,成功溯源了金黄色葡萄球菌的污染来源并完成病原菌种属定位。结论 本方法特异性好、灵敏度高、检测通量高,为冷链食品及相关食品中病原菌的精确检测与溯源分析提供新的思路与方法。

靶向高通量测序在非结核分支杆菌肺病诊断中的应用

非结核分枝杆菌(non-tuberculosis mycobacteria,NTM)肺病作为临床常见病种,近年来呈快速增多趋势,其诊断是临床亟待解决的难题,尽早明确菌株对NTM肺病的临床治疗有重要指导意义。传统检验方法因检测周期长、敏感度低、阳性率低等局限性常导致误诊、误治,已不能满足目前临床诊断的需求,靶向高通量测序(tNGS)技术是一项正在飞速发展的新兴技术,对比传统检验方法存在诸多优势,在一定程度上能够克服传统检验技术的缺点,并逐步应用于临床,但目前仍存在不足之处,本文对其在NTM肺病诊断中的应用做一综述。

基于纳米孔靶向全基因测序技术的新冠肺炎病例快速鉴定研究

目的探索快速识别新型冠状病毒的方法,为新冠肺炎防控提供技术支撑。方法分别运用基于三代纳米孔测序技术平台MinION Mk1C和基于二代测序技术平台Ion Torrent S5的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)靶向全基因组测序技术对1例境外输入新冠肺炎确诊病例进行基因组测序。使用artic-ncov2019软件、CLC Genomics Workbench(Version 21.0)软件和DNAstar软件等进行数据处理和分析。结果基于三代纳米孔测序技术平台MinION Mk1C和基于二代测序技术平台Ion Torrent S5分别在7 h和30 h左右获得SARS-CoV-2全基因组数据,分别为29848bp和29801bp,两者共同29801bp数据部分同源性100%,经分析为新冠病毒B.1.1.7变异株。结论在对该病例样本的全基因测序中,基于三代纳米孔测序技术平台MinION Mk1C的SARS-CoV-2靶向全基因组测序技术将检测周期缩短至7 h左右,能够实现快速、准确地对SARS-CoV-2进行实时测序。

基于高通量测序技术探讨参曲健脾颗粒对脓毒症患者肠道微生态调节作用

目的探讨基于高通量测序技术探讨参曲健脾颗粒对脓毒症患者肠道微生态调节作用。方法收集2021年3月—2022年5月医院重症医学科脓毒症患者8例(脓毒症组),在医院体检选取年龄相匹配的正常对照患者5例(对照组),留取健康对照组早晨起床后的粪便。脓毒症组的患者在住院时间内实施常规的治疗,同时口服院内制剂参曲健脾颗粒治疗,留取脓毒症组患者入院第1、3、5天晨起后第1次粪便,采用高通量测序技术对两组粪便样本进行肠道菌群分析,区分样本后按97%的相似度进行运算分类单位(OTU)聚类。物种丰度用Chao指数评估,菌群丰度用Shannon指数评价。利用门、属水平的菌落组成和丰度信息进行差异菌群分析。采用ELISA法对两组研究对象入院的第1、3、5天C反应蛋白(CRP)血清淀粉酶和白细胞介素8(IL-8)、IL-10水平实施检测。检测健康对照组和脓毒症组患者入院第1、3、5天的CD_(4)^(+)及CD_(8)^(+)的百分比并计算CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)的比值。结果脓毒症组患者入院的第1、3、5天CRP、血清淀粉酶、IL-8水平均高于对照组(P<0.05),IL-10均低于对照组(P<0.05),且脓毒症组随着入院时间的增加,血清淀粉酶、CRP、IL-8水平降低,IL-10水平增高;对两组共23个样本进行测序,得到OTU 702个,多数样本中的OTU Rank曲线较为平缓并且分布比较地集中,各样本的菌种自身的均匀度及其内含菌种的丰度较相似;两组肠道菌群多样性指数分析结果显示,脓毒症组Chao指数、Shannon指数均低于对照组(P<0.05),且脓毒症组随着入院时间的增加,Chao指数、Shannon指数在增加;脓毒症组丁酸弧菌属、钌杆菌属、颗粒链菌属、螺旋杆菌属丰度高于对照组(P<0.05),拟普雷沃菌属、帕拉普菌属、罗姆布茨菌属、优杆菌属丰度低于对照组(P<0.05),且随着入院时间的增加,脓毒症组丁酸弧菌属、钌杆菌属、颗粒链菌属、螺旋杆菌属丰度降低,拟普雷沃菌属、帕拉普菌属、罗姆布茨菌属、优杆菌属丰度增加;脓毒症组CD_(4)^(+)、CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)水平均低于对照组(P<0.05),CD_(8)^(+)水平均高于对照组(P<0.05),且随着入院时间的增加,脓毒症组CD_(4)^(+)、CD_(4)^(+)/CD_(8)^(+)水平升高,CD_(8)^(+)水平降低。结论通过高通量测序的技术分析健康者及脓毒症患者粪便内的菌群,发现脓毒症患者的益生菌丰度降低,有害菌丰度增加,存在暂时性的菌群失调,经参曲健脾颗粒干预后,菌群的变化可恢复正常,且可减轻患者机体的炎症反应,改善免疫功能紊乱,提升脓毒症患者的肠道菌群多样性。

基于高通量测序的贵州北部地区红腿长吻松鼠秋季食性分析

红腿长吻松鼠(Dremomys pyrrhomerus)是一种主要分布于我国的长吻松鼠,但对其生物学和生态学特征鲜有研究报道。为揭示红腿长吻松鼠的食物种类组成及其取食偏好,运用高通量测序技术对贵州北部地区采集的红腿长吻松鼠进行食性分析。结果表明:红腿长吻松鼠所食植物包含4门85科180属,动物包含3门59科71属,其中,胡桃科(Juglandaceae)、禾本科(Poaceae)、壳斗科(Fagaceae)、蔷薇科(Rosaceae)、鼠李科(Rhamnaceae)和樟科(Lauraceae)等是红腿长吻松鼠主要的植物性食物,而田螺科(Viviparidae)、蚌科(Unionidae)、剑水蚤科(Cyclopidae)、沼大蚊科(Limoniidae)、管蓟马科(Phlaeothripidae)和螽斯科(Tettigoniidae)等是其主要的动物性食物。此外,不同性别红腿长吻松鼠的食性具有一定的差异性,雌性红腿长吻松鼠的食物多样性均高于雄性,雌性和雄性的植物性食物重叠度较高,而动物性食物重叠度较低。研究结果丰富了黔北喀斯特台原地区小型哺乳动物的摄食生态学。

探析高通量测序技术在肺部感染性疾病中的应用进展

高通量测序技术也称二代测序技术(NGS),在临床中可作为多种病原体检测方法,具有准确性高、无偏倚等优势。肺部感染性疾病属于临床常见疾病,早诊断、早干预对挽救患者生命具有重要意义。但受临床抗生素不合理应用与患者个人情况影响,特殊病原体感染、重症感染及难治性感染的发生增加了诊断及治愈难度。这就要求对病原学微生物诊断方法进行深入研究,针对肺部感染性疾病诊疗现状,该文简要对NGS进行概述,并对NGS在肺部微生物群落检测、重症感染及特殊类型感染患者中的应用进展进行综述,探析NGS在肺部感染性疾病治疗中的应用。