靶向测序基因型检测(GBTS)技术及其应用

借助于分子标记进行基因型检测的技术在生物遗传改良等领域发挥着重要的作用。国际跨国种业公司凭借其高通量、自动化、大规模的共享检测平台,基因型检测技术得到广泛应用。随着从3G时代的高成本固相芯片和随机测序式基因型检测(genotyping by sequencing,GBS)发展到成本低、对检测平台要求较低、基于靶向测序基因型检测(genotyping by target sequencing,GBTS)的液相芯片,基因型检测技术完成了向4G时代的转变。在本文中首先介绍了两项最新的GBTS技术(基于多重PCR的GenoPlexs和基于液相探针捕获的GenoBaits)及其原理。同时,发展了可以在单个扩增子内检测多个SNP,称之为多聚单核苷酸多态性(multiple single-nucleotide-polymorphism cluster,mSNP或multiple dispersed nucleotide polymorphism,MNP)的技术,极大地提高了目标位点(扩增子)内变异的检测效率。与GBS和固相芯片相比,GBTS技术具有平台广适性、标记灵活性、检测高效性、信息可加性、支撑便捷性和应用广谱性。同一款标记集(例如玉米40K mSNP),可以获得3种不同的标记形式(40K mSNP、260K SNP和754K单倍型);并可以根据应用场景的需求,通过控制测序深度获得多种不同的标记密度(1-40K mSNP)。GenoPlexs和GenoBaits 2种技术相结合,可广泛应用于生物进化、遗传图谱构建、基因定位克隆、标记性状关联检测(全基因组关联分析——GWAS和混合样本分析——BSA)、后裔鉴定、基因渐渗、基因累加、品种权保护、品种质量监测、转基因成分/基因编辑/伴生生物检测等领域。目前,已经在20余种主要农作物、蔬菜以及部分动物和微生物中开发了GBTS标记50余套,并已广泛应用于上述领域。最后,展望了与未来GBTS应用相关的几个问题,包括便携式、自动化、高通量、智能化检测平台;根据用户需求定制的可变密度、多功能分子检测;GBTS与其他技术(KASP、高密度芯片、BSA策略等)的整合;基于资源共享的开源育种等。这些将推动GBTS技术在动物、植物和微生物遗传改良等领域的广泛应用。

基于靶向捕获测序的猪单倍型基因组选择效果研究

【目的】探索靶向捕获测序技术的猪单倍型基因组选择研究效果,为我国猪分子育种提供借鉴。【方法】收集了1267头大白猪的生长性能测定记录和800头大白猪的繁殖记录,利用基于靶向捕获测序技术(genotyping by target sequencing,GBTS)开发的猪50K液相芯片(液相50K)以及靶向捕获重测序数据进行基因型分型,对靶向捕获重测序数据进行单倍型分析,比较固定SNP数目、固定物理间距和靶向block三种单倍型区块划分方法以及单个SNP数据的基因组选择准确性。其中靶向block方法是基于靶向捕获测序技术设计的一种单倍型区块划分方法,通过将靶位点与其上下游400 bp内SNP(mSNP)组合为一个block的方式构建单倍型。本研究对每个单倍型区块采用Beagle5.1进行单倍型推断后,将不同单倍型重新编码为单倍型等位基因,然后利用单倍型剂量模型构建单倍型基因型矩阵,采用一步法模型(ssGBLUP),估计达百公斤体重日龄(AGE)、百公斤活体背膘厚(BF)和总产仔数(TNB)三个性状的基因组育种值。对两个生长性状(AGE和BF)使用双性状动物模型进行估计,对总产仔数性状使用单性状重复力模型。使用年轻群体验证和5倍交叉验证两种验证方法,计算基因组估计育种值与育种值之间的相关系数和基因组估计育种值对估计育种值的回归系数,分别评价单倍型基因组预测准确性和无偏性。【结果】年轻群体作为验证群体的基因组预测结果表明,相较于液相50K SNP,基因型质量控制后,靶向捕获重测序标记数由液相50K的42302增加到了88105,但其对三个性状的基因组选择准确性反而有所下降。通过靶向block方法划分的单倍型区块平均包含SNP 2.08个、单倍型等位基因5.67个。基于三种单倍型区块划分方法进行的单倍型基因组选择准确性都得到了提高,其中靶向block提升幅度最大,AGE、BF和TNB三个性状准确性比液相50K分别提高了4.80%,1.98%和6.04%,靶向block多数情况下基因组预测无偏性最优。交叉验证结果与年轻群体验证相似,靶向block方法相较于单标记SNP和其他单倍型区块划分方法均有一定优势,固定间距400 bp划分单倍型的基因组选择效果与靶向block单倍型接近但计算时间增加;固定2个和5个SNP单倍型区块划分方法单倍型基因组预测准确性较单个SNP均有一定提升,但低于靶向block单倍型。【结论】由于液相芯片标记的特点,靶向重测序数据mSNP与液相50K SNP芯片标记多数处于高度连锁不平衡状态,利用靶向block划分的单倍型基因组选择准确性优于50K SNP以及其他两种单倍型区块划分方法,进一步利用了液相芯片的技术优势,拓宽了基于GBTS技术的液相芯片在基因组分析方面的应用。

基于靶基因文库的高通量测序平台建立肥厚型心肌病患者致病基因突变检测方法

目的基于靶基因文库,应用下一代半导体高通量测序平台,建立快速、准确的肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy,HCM)常见致病基因突变检测方法,有利于HCM患者的早期预防及临床分子诊断。方法选择国内外公认的与HCM致病相关的常见基因(MYH7,MYBPC3,TNNT2,TNNI3,ACTC1,PRKAG2,MYL2和MYL3),应用Primer5及Primerselect引物设计软件对靶基因编码区进行引物设计。基于下一代半导体高通量测序平台,对2019年3月至8月在大理大学第一附属医院采集的4例HCM患者外周静脉血液标本,提取基因组,构建靶基因文库,进行上机测序,测序质量评估及变异位点注释。最后对注释分析得到的与HCM致病相关的突变位点进行Sanger测序验证。结果通过建立的高通量测序方法,检出了4个与HCM致病相关的突变位点MYBPC3-c.478 C>T,MYH7-c.161 G>A,TNNI3-c.370 G>C和MYL3-c.337 A>G,并通过金标准的Sanger测序验证,结果完全一致。结论基于靶基因文库及高通量测序平台建立的HCM患者常见致病基因突变检测方法,能为临床分子诊断实验室工作者开展遗传基因突变检测提供参考.

低深度全基因组测序技术联合核型分析在无创产前检测高风险孕妇产前诊断中的应用

目的探索低深度全基因组测序技术联合核型分析在无创产前检测高风险孕妇产前诊断中的应用。方法对165例无创产前高风险孕妇行羊膜腔穿刺术,在对胎儿羊水样本进行G显带染色体核型分析的同时采用低深度全基因组测序技术检测胎儿羊水细胞基因组DNA,测序结果与人类参考基因组(GRCh37,UCSC release hg19)进行比对分析,然后通过ISCA、Decipher、ClinVar等数据库评估检测到的CNV致病性,进而比较G显带染色体核型分析与低深度全基因组测序结果间的差异。结果送检的165例羊水样本中低深度全基因组测序检测出21三体44例,18三体10例,13三体1例,与G显带染色体核型分析结果一致;性染色体异常2例,比G显带染色体核型分析多检出1例;其他类型染色体异常10例,比G显带染色体核型分析多检出4例。低深度全基因组测序技术对染色体异常的总检出率为53.33%,与染色体G显带核型分析比较,致病性异常检出率提高了3%。结论低深度全基因组测序技术在无创产前检测高风险孕妇产前诊断中有良好的应用价值,该技术与G显带染色体核型分析联合应用能有效提高染色体异常检出率,降低出生缺陷,提高人口素质。

PCR-焦磷酸测序技术在HPV型别检测中的应用

宫颈癌是严重危胁妇女生命健康的最常见恶性肿瘤之一,全球每年新发病例约52.98万,死亡病例25.51万,80%发生在发展中国家[1]。早期宫颈癌如能及时发现并治疗,治愈率可达90%以上。高危型人乳头瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)持续感染是宫颈癌的主要致病因素,不同HPV亚型引起宫颈癌的危险性不同,其中HPV16和HPV18是致癌能力最强的基因型,70%的浸润性宫颈癌与其相关[2]。因此,HPV感染筛查及型别检测是预防和控制子宫颈癌的重要手段。对30~65岁已婚妇女而言。

基因芯片检测血清标本的丙型肝炎病毒基因型

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV )基因分型检测芯片在临床的初步应用及意义。方法:基因芯片检测15 0例血清标本中HCV基因型,并与HCV RNA定性及测序结果进行比较。结果:HCV基因分型检测芯片检出的阳性结果与HCV- RNA定性及测序结果的相对符合率为10 0 .0 %。结论:HCV基因分型检测芯片是一种准确性好、灵敏度高、特异性强、操作简便快速的基因检测方法,可以为临床诊断。

膜显色DNA芯片技术检测丙型肝炎病毒基因型及临床意义

目的了解丙型肝炎病毒基因型分布及其临床意义。方法应用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)对89例抗HCV阳性血清进行HCVRNA扩增,再应用膜显色DNA芯片技术,对HCV进行基因分型,并对部分标本用基因测序法作对照。结果89份抗HCV阳性血清中,检测出HCVRNA阳性73例。其中,HCV/1b型66例(90.4%),HCV/1a型1例(1.4%),2a型3例(4.1%),3b型3例(4.1%)。13例标本作基因测序分型对照,分型结果完全一致。15例献血员血清中未检出HCVRNA。结论HCV/1b型是江苏常州地区丙肝病毒优势株。膜显色DNA芯片可用于HCVRNA检测及基因分型检测,方法简便、快速、准确,适合临床推广应用及流行病学研究。

扩展性无创产前基因检测在产前诊断中的应用

目的探讨扩展性无创产前基因检测(NIPT-plus)在产前诊断中的应用价值。方法选取2020年4月至2021年12月在阜阳市人民医院就诊的159例NIPT-plus结果提示高风险的孕妇,所有孕妇均行羊膜腔穿刺术,同时进行染色体核型分析联合染色体微阵列分析(CMA)或染色体拷贝数变异(CNV)测序(CNV-seq)并进行随访,对所有孕妇的检测结果和妊娠结局进行汇总分析。结果159例NIPT-plus高风险孕妇中,21三体36例、18三体11例、13三体2例、性染色体数目异常58例、其他染色体数目异常30例、CNV 22例。159例孕妇羊水样本通过染色体核型分析联合CMA/CNV-seq检测共检出70例与NIPT-plus结果一致的异常样本和4例非NIPT-plus提示的其他异常。NITP-plus对21三体、18三体、13三体、性染色体数目异常、其他染色体数目异常、CNV的阳性预测值分别为75.0%(27/36)、72.7%(8/11)、0(0/2)、36.2%(21/58)、6.7%(2/30)和54.5%(12/22)。4例非NIPT-plus提示的其他异常的CNV片段大小均小于3 Mb,包括1例致病性变异、3例临床意义未明变异。结论NIPT-plus具有较高的准确度,对常见的染色体非整倍体异常和拷贝数变异具有一定的预测价值,同时建议NIPT-plus提示高风险的孕妇,运用染色体核型分析联合CMA或CNV-seq进行进一步的产前诊断,以确定胎儿是否存在染色体变异。

基于全基因组重测序的白化茶树mSNP标记开发及验证

为探究白化茶树遗传变异信息及mSNP液相芯片在茶树种质资源鉴定中的可行性,利用全基因组重测序对18份白化茶树资源进行遗传多样性分析和突变位点检测。结果表明,基于全基因组水平的SNP标记可将18份白化茶树资源分为3类,且基本呈现出具有亲缘关系或地理位置接近的资源聚在一起的趋势;对重测序数据进行功能注释后发现,在18份白化茶树资源中存在17 056个共有非同义突变基因,其中14个叶绿素合成相关基因中存在98个错义突变位点。随后,基于前期获得的基因组变异信息开发了一套包含59个mSNP、222个SNP位点的液相芯片,利用该液相芯片检测13份茶树资源的基因型信息。结果表明,同一品种两两之间的遗传相似度在92%~98%,不同品种间的遗传相似度则在84%以下,表明该芯片可对18份白化茶树资源进行准确鉴别,研究结果可为mSNP液相芯片在茶树种质资源鉴定、分子标记辅助育种等方面的应用奠定基础。

染色体嵌合体在基因检测中的研究进展

染色体嵌合体是指个体中存在两个或多个染色体不同的细胞系,这些细胞系来源于单个受精卵。染色体嵌合体标本来源困难、临床结局多样导致临床结果解释和检测困难,是基因研究的难点之一。本文将对嵌合体的形成机制、致病性以及基因检测技术等进行综述,为临床治疗和产前遗传咨询提供更好的诊疗依据。

TP-M13自动荧光检测法在高粱SSR基因型鉴定中的应用

研究利用TP-M13自动荧光检测法对48份高粱材料进行了简单序列重复(SSR)标记的基因型鉴定。在这个方法中,需要合成一个普适性的用荧光(如FAM)标记的M13引物,并把M13的正向引物和一个SSR反向引物相连(称为TP-M13引物),利用3条引物序列进行PCR扩增,其PCR产物在DNA测序仪(如ABI3700仪)上进行自动荧光检测。结果表明,这种方法和其他的传统方法相比,具有经济、灵敏、高效的优点。建议在利用数量很多的SSR标记对数量有限的基因组较小的材料进行基因型鉴定时,使用TP-M13自动荧光检测系统。

20例份血清学弱D表型抗凝血液标本的RHD基因型检测分析

目的对20例份血清学弱D表型(SWDP)抗凝血液标本进行RHD基因型检测。方法20例份受检抗凝血液标本,均经盐水介质法、间接抗球蛋白法鉴定为SWDP。采用SSP-PCR法进行RHD基因型检测,如不能确定基因型则采用DNA序列分析技术(SBT)进行基因测序。结果20例份SWDP抗凝血液标本中,弱D15型RHD等位基因12例份、部分D型RHD等位基因6例份[DⅥⅢ型5例份、DVA(Hus)型1例份]、DEL型RHD等位基因1例份(1227 G>A),1例份未能确定基因型。未能确定基因型的标本,其RHD基因第8外显子的1100号碱基发生T>A的纯合突变,为新发现RHD等位基因。结论SWDP抗凝血液标本中弱D15型RHD等位基因较多,其次为DⅥ型。新发现1例RHD等位基因。

全外显子组测序法鉴定中国Ⅰ型Stickler综合征一家系致病基因

目的鉴定Ⅰ型Stickler综合征一家系的致病突变。方法采用家系调查研究方法,收集2012年6月在汕头国际眼科中心就诊的来自中国潮汕地区的Ⅰ型Stickler综合征一家系。对参与调查的家系成员进行病史采集及临床检查,包括视力、眼压、裂隙灯显微镜和眼底检查等,并由经验丰富的临床医生进行诊断。采集该家系5例患者和4名表型正常者的外周静脉血各5 ml并提取基因组DNA;采用全外显子测序技术及相关生物信息学筛查方法对先证者父亲Ⅲ-5进行全外显子测序及致病突变筛选;采用Sanger测序对突变进行验证;采用SIFT、Polyphen2、MutationTaster分析变异位点致病性;采用氨基酸多序列比对及UniProt结构域预测分析变异位点氨基酸保守性及蛋白质三维结构。结果该家系为常染色体显性遗传方式。共4代39人,其中患者15例,表型正常者24人。先证者Ⅳ-4右眼高度近视、视网膜脱离、斜视,左眼盲;患者Ⅲ-5右眼高度近视、白内障,左眼眼球萎缩;患者Ⅳ-9双眼高度近视。患者Ⅲ-5全外显子测序结果显示,COL2A1基因26号外显子c.1693C>T:p.565Arg>Cys位点变异。Sanger测序分析结果显示,COL2A1突变仅存在于被检患者中,未出现在表型正常者中,符合家系共分离。该变异位点经SIFT、Polyphen2、MutationTaster预测分析为有害性突变,COL2A1蛋白氨基酸序列第565位精氨酸在人、小鼠、大鼠、牛、非洲爪蟾中高度保守,此氨基酸位于该基因的三螺旋功能结构域,此突变使蛋白质在三螺旋重复区域Gly-X-Y发生了变化,X位置的精氨酸残基变为半胱氨酸残基,影响纤维蛋白功能,从而产生致病性。结论COL2A1基因c.1693C>T变异为该家系的致病基因变异位点,该变异位点首次在国内报道。

高通量靶向Panel测序新型突变对癫痫遗传多样性的临床价值

目的采用高通量靶向Panel测序检测癫痫相关突变及通过千人基因组数据集对比发掘癫痫相关新型突变位点,探索癫痫遗传多样性的临床价值。方法共纳入癫痫病例169例,原发性癫痫69例,继发性癫痫100例,使用高通量靶向Panel测序检测癫痫相关突变。测序结果通过与千人基因组328个样本的数据集进行比较,按照(1)千人基因组对照数据集——全癫痫患者(原发+继发);(2)千人基因组对照数据集——原发癫痫;(3)千人基因组对照数据集——继发癫痫的分组查找差异,按照哈温平衡检验(HWE_P>0.05)、χ~2检验(P<0.05)筛选并按照突变的病例比例(≥10%)排序,结果与HGMD、ClinVar数据库比较,确定为新型突变。结果在癫痫患者组中发现新型突变13个;在原发性癫痫组中发现新型突变11个,其中4个为原发性癫痫患者特有位点;在继发性癫痫组中发现新型突变18个,8个为继发性癫痫患者特有位点。通过对突变基因的功能分析,得到了原发性和继发性癫痫特有的遗传致病位点和遗传易感性位点。结论高通量靶向Panel测序检测到的新型移码突变有效地揭示了不同癫痫类型的遗传多样性。

核酸测序法与荧光PCR法测定HBV基因分型比对试验研究

探讨核酸序列测定法(以下简称核酸测序法)与荧光PCR法测定乙型肝炎病毒(HBV)基因分型的效果。方法 选择2020年5月至2021年6月期间在本院进行健康体检的185例体检者血样作为研究资料。留取体检者血样,分离血清后冷冻保存,样本均分为两份,分别采用核酸测序法与荧光PCR法测定HBV基因分型,对比两者各基因型检出情况,以核酸测序法为金标准,参照其检测结果,评估荧光PCR法检测的灵敏度、特异度和准确性。结果 核酸测序法检测结果显示:82例体检者为HBV携带者(阳性),阴性者103例。荧光PCR法检测显示:83例体检者为HBV携带者(阳性),阴性者102例。核酸测序法是HBV检测的金标准,以此为参照,荧光PCR法对HBV诊断灵敏度为98.78%、特异度为98.06%、准确率为93.38%。核酸测序法对HBV B型、HBV C型、HBV D型和HBV A型检出率与荧光PCR法比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 荧光PCR法对HBV基因分型的诊断准确性高,且具有灵敏度好、特异度高等优势,与核酸测序法比较,诊断结果一致性较好,可作为HBV筛查与分型检测的首选检测方法。

柞蚕核型多角体病毒基因组编码VmiRNA的预测与功能分析

柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)是危害柞蚕的主要病原物之一。病毒microRNAs(VmiRNA)是由病毒基因组编码的小RNA分子,在病毒繁殖及与宿主的相互作用中发挥作用。采用高通量测序Solexa技术测定ApNPV感染柞蚕后的VmiRNA,并通过vMir软件预测ApNPV基因组可能编码的VmiRNA前体序列。在预测得到的16条前体序列中,有13条能够从病毒感染的柞蚕蛹脂肪体中扩增出条带,并有10条能在病毒基因组中找到同源序列。在ApNPV MicroRNA Solexa测序数据库中搜索到与这10条前体VmiRNAs相匹配的序列,用RT-PCR方法证明有9条能扩增出大小相应的片段,确定其为病毒基因组编码的VmiRNA的成熟序列。利用靶基因在线预测程序RNAhybrid预测到这些VmiRNA作用的135个可能的靶基因,其中有与免疫应答过程相关的基因36个,与免疫系统进程相关的基因19个,与免疫调节相关的基因8个,与免疫系统发育相关的基因9个。推测这些ApNPV基因组编码的VmiRNA在病毒与宿主之间的相互作用中扮演重要角色。

垂直变性梯度凝胶电泳在大肠癌APEX基因变异检测中的应用

目的探讨变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)在大肠癌APEX基因单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)或基因突变筛选中的应用价值。方法对散发性大肠癌APEX基因5个外显子进行DGGE检测及DNA测序,分析DGGE带型和测序结果之间的关系。结果根据DGGE原理及实验观察结果,发现无论何种碱基改变,在DGGE胶上通常只可能呈现4种带型中的一种,本研究发现其中的3种。杂合子的特征是在变性胶的泳道上出现不同水平的4条带,纯合子呈单一条带;带有错配的DNA分子在凝胶上的位置总是落后于没有错配的分子;当碱基改变为A/T→G/C时,突变DNA分子泳动较快,其条带位于野生型分子之前,当碱基改变为G/C→A/T时,结果相反。结论对于一已知的SNP,利用DGGE带型可以判断SNP的基因型和等位基因频率而免去进一步测序工作;对突变检测而言,DGGE可预测碱基改变的类型,有利于对测序结果判读的准确性。

新一代测序技术应用于microRNA检测

MicroRNAs（miRNAs）是一类在进化上高度保守的非编码小分子单链RNA（~22nt）,在基因转录后调控中发挥至关重要的作用。越来越多的证据表明,miRNAs参与很多重要的生理和病理过程,例如发育、器官形成、调亡、细胞增殖、肿瘤发生等。近年来飞速发展的新一代测序技术在miRNA检测方面具有重要的应用。文章简要介绍了新一代测序技术3大平台的基本步骤和原理,测序数据的生物信息学分析方法以及新一代测序技术在miRNA方向的主要应用。相比于传统的miRNA检测方法,新一代测序技术具有通量高、对遗传物质检测完全且准确度高,可重复性好等优点,在探索新miRNA、miRNA互补链、miRNA编辑、miRNA异构体检测以及miRNA靶基因检测等方面具有巨大优势。随着新一代测序技术的不断发展,测序成本不断降低,在未来几年,新一代测序技术的使用率或将大大增加。新一代测序技术的不断应用将进一步促进人类对于miRNA在各种生理病理过程中的功能和调控的认识。

肾癌基因检测中国专家共识(2021版)

肾癌占全球新发肿瘤病例的2.2%,占死亡病例的1.8%[1]。近年来,我国肾癌的发病率呈持续增长的趋势,早期肾癌可以手术切除,预后较好。约20%~30%的肾癌术后会出现复发和转移。转移性肾癌(metastatic renal cell carcinoma,mRCC)对常规放化疗不敏感,预后较差,死亡率高,对患者的生命构成了极大的威胁和影响。目前,酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors,TKIs)、mTOR抑制剂和免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibiter,ICI)为mRCC的主要治疗方法。

基因检测或迎来医保春天

下一代基因测序（NGS）终于融入美国医保大家庭。借助于纷繁多样的新方法，下一代基因测序技术将肩负起在平行序列测定大量DNA的快速数据生成能力。部分下一代基因测序技术适用于筛检出人群是否存在某些特定遗传性癌症高危险，实际例子是Myriad遗传性癌症风险测试。不止于此，它还可被用于明确癌症患者的基因变异特征，进而尽早从癌症靶向治疗的非适应证用药的新希望中受益。