基于基因组编辑技术的水稻靶向突变特征及遗传分析

TALEN(Transcription activator-like effector nucleases)系统和CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)系统是当前广泛应用的两大基因组编辑技术。本文比较分析了水稻(Oryza sativa L.)中这两大系统诱导突变的突变率、突变类型、突变位置、突变时间和遗传模式,发现TALEN系统和CRISPR/Cas9系统均可在T_0代水稻中有效诱发位点特异性突变,且CRISPR/Cas9的突变率更高。两大系统都以诱发10 bp以内的In Del突变为主,TALEN系统易诱导10 bp以内的缺失突变,而CRISPR/Cas9系统易诱导1 bp的插入突变,且CRISPR/Cas9系统诱发的DNA双链断裂(Double-strand breaks,DSBs)位置更加精确。此外,DSBs在修复过程中能以低频同源重组(Homologous recombination,HR)途径修复,产生DNA片段重复突变。对于相邻双靶点CRISPR/Cas9系统而言,双靶点间的DNA片段可发生缺失或倒位,这种双靶点间DNA片段突变的发生频率与双靶点各自的突变率无正相关性。两大系统诱导的突变最早发生在已转化的愈伤组织中,少量发生在水稻的体细胞中,导致了纯合突变、杂合突变、双等位突变和嵌合突变4种遗传模式,其中双等位突变比例最高,嵌合突变比例最低。除嵌合突变外,纯合突变、杂合突变、双等位突变的突变序列均可稳定遗传给下一代。

植物CRISPR/Cas9基因组编辑系统与突变分析

基因组定点编辑技术通过可编码核酸酶切割基因组特定位点,进而诱导基因组定点突变。CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)基因组编辑系统由Cas9核酸酶以及sg RNA(Single guide RNA)组成,与其他可编码核酸酶系统如锌指核酸酶(Zinc finger nucleases,ZFNs)和类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALENs)相比具有更简便的操作性和更高的基因组定点编辑效率。目前在植物中已有多例应用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑的报道。本文从Cas9基因与sg RNA表达载体的构建策略,获得基因组定点编辑突变体的转化方法、突变的效率和特征、突变的检测方法等方面进行了总结,最后对植物中利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑存在的问题以及发展前景进行了讨论。

TAL效应子介导基因组DNA的靶向修饰

植物黄单胞菌病原细菌分泌的TAL效应子(Transcription activator-like effector)可结合特异的双链DNA。TAL是由序列几乎相同的多个DNA结合域的重复串联而构成的,每个DNA结合模块的重复可变双残基特异识别一个DNA碱基。TAL和核酸修饰相关功能域融合而成的定制TAL效应子(dTALE)能特定靶向修饰基因组DNA,在新近遗传工程中扮演重要角色。目前,TAL效应子与核酸酶FokI融合成的TALEN核酸酶(TALEN)能够靶向识别基因组位点并由核酸酶切割双链DNA造成双链断裂,通过同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)进行双链修复从而引发特定位点的基因突变。TALENs在多个模式生物中都具有较高的靶向有效性,而且TAL效应子DNA结合域可进行模块化设计,能够发展成高通量的基因靶向修饰和调控的平台,具有广阔的实际应用前景。对TAL效应子特异识别DNA的结构分析、TALENs的设计策略以及TAL效应子在基因组靶向修饰中的应用与展望等方面进行了概述。