细胞靶向肽在多肽偶联药物中的研究进展

靶向治疗利于提高治疗效率,减少不良反应,克服耐药性,特别在癌症治疗领域被广泛运用。多肽偶联药物(PDC)由归巢肽、连接臂和具有药理作用的有效载荷构成。其中归巢肽包括细胞穿透肽(CPP)及细胞靶向肽(CTP),在整个分子中作用重要,决定了分子穿透生物膜并靶向特定靶标的能力。介绍了PDC中CTP的种类、递送药物的应用等,为CTP及其用于新型PDC研发提供指导,推进新型PDC的研发进程。

靶向肽在递送siRNA进行肺癌治疗研究中的应用

肺癌被认为是全球发病率最高的一种恶性肿瘤,其对化疗药物不敏感且易产生耐药性,因此增强肺癌药物治疗效果是近年来研究的热点。siRNA是一种小RNA分子,可以沉默与之互补的目标mRNA,是一种基因治疗手段。靶向肽是一类小分子多肽,它可以与siRNA联合使用,利用其与肿瘤表面物质特异性结合发挥靶向作用。联合靶向肽的特异性和siRNA的治疗作用,增加siRNA在靶点位置的聚集,增强沉默效果,可以提高肺癌对药物的敏感性并降低耐药作用,进而增强肺癌治疗效果,为肺癌的靶向治疗提供新的方向和策略。本文将对靶向肽在递送siRNA进行肺癌治疗研究中的应用作一简要综述。

关于^(131)I标记酪氨酸修饰的血管靶向肽GX1用于消化道肿瘤诊治的实验研究

目的:设计合成酪氨酸(Tyr)修饰的肿瘤血管靶向肽(GX1),分析^(131)I标记短肽Tyr-GX1在荷消化道肿瘤裸鼠体内的显影特征,探讨^(131)I标记短肽Tyr-GX1作为肿瘤血管靶向诊治的可能性。方法:通过Iodogen碘标法对Tyr-GX1进行^(131)I标记,检测标记率和稳定性;建立裸鼠模型并注射标记肽,分析胃癌组和结肠癌组24 h显像结果。结果:用直接标记法标记Tyr-GX1、GX1短肽,测定标记率提示无需纯化;本研究Tyr-GX1与肿瘤组织结合率较高。胃癌组Tyr-GX1组自8 h开始,肿瘤部位放射性浓聚灶高于心血池本底,随时间延长逐渐递增;结肠癌组Tyr-GX1组也自8 h开始出现放射性浓聚,随时间延长逐渐递增,到18 h达到高峰后略有下降,肿瘤部位和心血池本底放射性比值始终高于1;两种消化道肿瘤的浓聚及达到峰值时间各有特征;结肠癌组T/NT数值持续高于胃癌组。结论:本研究提示^(131)I标记短肽Tyr-GX1具有良好的体内肿瘤血管靶向性,与肿瘤组织结合率较高,且两种消化道肿瘤的浓聚及达到峰值时间各有特征。^(131)I标记短肽Tyr-GX1作为肿瘤血管靶向诊治具有一定价值和可能性。

肺癌治疗中靶向肽在递送siRNA中的应用价值

目的探讨肺癌治疗中靶向肽在递送siRNA中应用的价值,旨在提升肺癌患者临床治疗有效率。方法选取2011年1月至2015年2月我校附属医院收治的肺癌患者80例,随机分为观察组和对照组,各40例。给予对照组患者常规化疗和靶向治疗;对于观察组患者,除常规化疗和靶向治疗外,还应用必要的靶向肽,并将两组患者的最终治疗效果进行比较。结果观察组临床治疗有效率明显高于对照组(P<0.05);观察组不良反应发生率明显低于对照组(P<0.05);观察组白细胞和血小板减少的发生率显著低于对照组(P<0.05)。结论靶向肽可以起到递送siRNA的作用,能增强靶向性,从而增强肺癌的治疗效果,不仅能提高治疗有效率,还能在降低患者不良反应发生率的基础上延长患者生存期。

人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞特异性靶向肽的筛选及验证

目的:利用噬菌体随机肽库筛选与人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞存在特异性结合的多肽,为实现对肺泡Ⅱ型上皮细胞的靶向干预和开发针对急性肺损伤等呼吸系统疾病治疗的导向药物载体提供实验依据。方法:采用全细胞筛选的方式,通过对人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞的4轮筛选和与人前列腺癌上皮PC-3细胞的差减筛选,从噬菌体随机肽库中筛选出与人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞存在特异性结合的多肽,选择丰度较高的一条命名为NTG,用其构建含有增强绿色荧光蛋白(EGFP)的原核表达载体,转化感受态细菌,层析法获得重组蛋白His-NTG-EGFP,测定其分子质量。向A549细胞和PC-3细胞分别加入含有重组蛋白His-NTG-EGFP或His-EGFP的培养基,荧光显微镜下观察。结果:从第1轮至第4轮,淘选所得的噬菌体回收率逐步提高,经过PC-3细胞差减筛选,少量的与A549细胞存在特异性结合的噬菌体得到了回收。重组表达并纯化得到的His-NTG-EGFP,测定其分子质量为33 k D,与预期相符。荧光显微镜下观察发现,经融合蛋白His-NTG-EGFP处理后的A549细胞表面有绿色荧光分布,经融合蛋白His-NTG-EGFP处理后的PC-3细胞以及经对照蛋白处理的A549细胞和PC-3细胞表面均未出现绿色荧光,说明这一融合蛋白可以特异性结合A549细胞。结论:人肺泡Ⅱ型上皮A549细胞特异性靶向肽被成功获得。

利用噬菌体肽库序贯筛选组织因子靶向肽

目的:建立一种高效的筛选跨膜受体靶向肽的噬菌体展示新方法,据此筛选出组织因子(TF)高亲和力靶向肽。方法:分别以纯化TF蛋白和具有TF高特异性表达的结直肠癌细胞株HT-29为靶标,用噬菌体七肽库进行序贯筛选(受体-细胞序贯筛选法,STRCA法),ELISA初步鉴定噬菌体克隆对HT-29亲和力。对噬菌体克隆进行测序,利用竞争抑制ELISA比较各合成肽的TF结合力。重复实验检测筛选结果的可靠性。结果:经过5轮筛选,与TF结合的噬菌体得到了富集,回收率由(2.25×10-4)%增加到(1.32×10-2)%;ELISA结果显示30个克隆中,阳性率为76.7%。噬菌体测序结果中,4种合成肽(分别命名为A、B、C、D肽)中A肽序列重复率为23.3%(7/30),B肽为23.3%(7/30),C肽为26.7%(8/30),D肽为10.0%(3/30);E肽为A、B肽合成的复合靶向肽。经竞争抑制ELISA比较5种肽的TF亲和力,其IC50分别为3.25 nmol/L、6.72 mol/L、3.24×103 mol/L、2.08×102 mol/L和45.77 mol/L。重复实验所获得的阳性噬菌体克隆序列与第1次实验相比,重复率为33.3%。结论:STRCA法是一种理想的筛选跨膜受体靶向肽方法,采用该法获得的TF靶向肽对TF具有高度的亲和力。

M细胞靶向肽对FaeG抗原的免疫增强作用

为研究M细胞靶向肽co1的免疫增强作用,本研究从肠产毒素性大肠杆菌(ETEC)全基因组中扩增FaeG基因,通过重叠延伸PCR的方法将人工合成的co1靶向肽编码序列连接到FaeG基因的3'端,获得FaeG-co1融合基因。并分别将FaeG和FaeG-co1基因克隆到pET-30b表达载体中,转化于大肠杆菌BL21(DE3)进行表达。SDS-PAGE和western blot分析显示,FaeG和FaeG-co1基因在大肠杆菌中均获得了高效表达,表达产物主要以包涵体形式存在。分别用两种重组菌表达的包涵体免疫昆明鼠,测定特异性IgG、sIgA抗体水平,并用ETEC强毒株对免疫鼠进行攻毒。结果表明,FaeG-co1重组蛋白免疫小鼠诱导机体产生的特异性IgG和sIgA抗体水平均显著高于FaeG组;FaeG-co1组两次免疫后即可对ETEC致死剂量的攻毒保护率达到100%。这些结果表明M细胞靶向肽对抗原具有免疫增强作用,是一种极具应用前景的免疫增强分子。

整合素靶向肽促进SD大鼠骨髓间充质干细胞的增殖

背景:研究报道整合素靶向肽多巴胺-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(dopamine-arginine-glycine-aspatic acid,DOPA-RGD)可以抑制破骨细胞活化和促进细胞黏附,然而对于整合素靶向肽干预骨髓间充质干细胞或改性钛基材料的最适浓度及最适时间尚不明确。目的:探究DOPA-RGD肽促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖的最适干预质量浓度及最适干预时间。方法:体外分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,选取纯度达标的细胞进行下一步干预实验。96孔培养板中接种第3代骨髓间充质干细胞,对照组细胞培养采用单纯α-MEM完全培养基,其余各实验组用含2.5,5,10,20,40,80 mg/L DOPA-RGD肽条件培养基培养,CCK-8法测定DOPA-RGD肽干预1,3,5,7 d的细胞增殖情况,筛选出DOPA-RGD肽干预骨髓间充质干细胞的最适质量浓度及干预时间,流式细胞仪测定细胞凋亡率进一步验证最适干预质量浓度,采取划痕实验验证最适质量浓度DOPA-RGD肽对骨髓间充质干细胞迁徙能力的影响。结果与结论:①重复测量方差分析结果显示,DOPA-RGD肽干预不同时间组间的吸光度值改变不同,干预至第5天时增殖效果最佳,存在显著性差异(F=3012.618,P<0.001),通过LSD法对分组因素行组间两两比较,10 mg/L DOPA-RGD肽组与质量浓度≥20 mg/L的3个DOPA-RGD肽组及对照组比较存在显著性差异(P<0.01);②细胞凋亡率测定显示,与其余各组相比,10 mg/L DOPA-RGD肽干预第5天可显著降低骨髓间充质干细胞的凋亡率(P<0.001);③与对照组相比,10 mg/L DOPA-RGD肽干预24 h后骨髓间充质干细胞呈现出一定迁徙能力,迁徙速度明显加快;④结果表明,10 mg/L DOPA-RGD肽干预第5天对骨髓间充质干细胞有显著的促增殖效应。

脑靶向肽修饰的BDNF对阿尔茨海默症小鼠的神经保护作用

目的探讨脑靶向肽修饰的脑源性神经营养因子(BDNF)对阿尔茨海默症小鼠的神经保护作用。方法使用基因工程的方法将一段脑靶向肽(TGN)与BDNF连接,诱导表达获取重组蛋白(TGN-BDNF),聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(WB)鉴定重组蛋白。将重组蛋白腹腔注射至APP/PS1双转基因小鼠,酶联免疫吸附试验(Elisa)检测脑组织中BDNF的含量。实验分为4组:对照组、模型组、BDNF组、TGN-BDNF组,Morris水迷宫试验测定小鼠的空间学习记忆能力,Elisa检测海马中Aβ、Tau蛋白和乙酰胆碱的含量,WB检测TrkB/Erk/CREB信号通路的表达。结果 BDNF和TGN-BDNF的分子质量分别为15.79kd和17.10kd,经SDS-PAGE与WB鉴定正确。与模型组和BDNF组相比较,TGN-BDNF组脑组织中BDNF的含量在注射后30min、1h和3h时升高(P<0.05),在注射后6h时无统计学差别(P>0.05)。与模型组和BDNF组相比较,TGN-BDNF组小鼠第5d的潜伏期下降,穿台次数上升(P<0.05);海马中Aβ和Tau蛋白含量下降,乙酰胆碱含量上升(P<0.05);海马中p-TrkB、p-Erk和p-CREB的表达升高(P<0.05)。结论脑靶向肽修饰的BDNF具有良好的脑靶向性,能够改善阿尔茨海默症小鼠的空间学习记忆能力,降低海马Aβ和Tau蛋白含量,增加乙酰胆碱含量,促进TrkB/Erk/CREB信号通路的活化,为阿尔茨海默症的治疗提供了新的思路。

Neuropilin-1靶向肽对人口腔鳞状细胞癌细胞株化疗敏感性的影响

目的探究神经菌毛素-1(NRP-1)靶向肽EG3287对人口腔鳞状细胞癌化疗敏感性的影响。方法首先构建NRP-1敲低的Tca8113细胞株(KD-Tca8113)和BcaCD885细胞株(KD-BcaCD885),采用CCK-8试剂盒检测野生型和NRP-1敲低型细胞株对化疗顺铂的敏感性,计算半数致死剂量(IC50)。以乱序肽为对照,评估NRP-1靶向肽EG3287对野生型Tca8113和BcaCD885细胞对顺铂敏感性的影响。结果流式细胞术结果显示,EG3287肽对NRP-1具有明显的靶向作用;CCK-8结果显示,顺铂对WT-Tca8113、KD-Tca8113、WT-BcaCD885和KD-BcaCD885的IC50分别为(5.32±0.44)、(0.56±0.02)、(4.98±0.57)和(0.64±0.03)μg/ml。野生型细胞IC(50)明显比NRP-1敲低细胞高(P<0.01)。在IC(50)剂量的顺铂处理下,EG3287肽组的细胞凋亡率明显较空白对照组和乱序肽组高(P<0.01)。结论NRP-1表达量与人口腔鳞状细胞癌Tca8113和BcaCD885细胞株对顺铂的敏感性呈负相关,NRP-1靶向肽能明显提高细胞对顺铂的敏感性。

线粒体靶向肽SS31及RIP抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)对H2O2诱导的氧化应激损伤ARPE-19细胞的保护作用

目的探讨线粒体靶向肽SS31及RIP抑制剂Necrostatin-1(Nec-1)对H2O2诱导的氧化应激损伤ARPE-19细胞的保护作用。方法选择400μmol·L-1 H2O2构建氧化应激损伤模型;根据MTT结果筛选出1μmol·L-1 SS31、40μmol·L-1 Nec-1作为实验最佳浓度。将培养的细胞分为对照组、SS31+Nec-1组、H2O2组、SS31+H2O2组、SS31+Nec-1+H2O2组、Nec-1+H2O2组。利用MTT测定细胞存活率,双氯荧光素染色测定细胞活性氧自由基(ROS)水平,JC-1染色测定线粒体膜电位,AnnexinV/PI双染检测细胞PI阳性率,Western blot法检测RIP3蛋白表达水平。结果与对照组相比,H2O2组细胞存活率明显降低(P<0.05)。SS31+H2O2组、Nec-1+H2O2组细胞存活率高于H2O2组,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。荧光显微镜下双氯荧光素染色结果显示,与H2O2组相比,SS31+H2O2组、Nec-1+H2O2组绿色荧光明显减弱,细胞内ROS含量明显减少。流式细胞仪结果显示与对照组相比,H2O2组线粒体膜电位降低的细胞比例升高,差异有统计学意义(P<0.05);与H2O2组相比,SS31+H2O2组、Nec-1+H2O2组线粒体膜电位降低的细胞比例降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。AnnexinV/PI双染色结果显示与对照组相比,H2O2组PI阳性率增加;与H2O2组相比,SS31+H2O2组、Nec-1+H2O2组PI阳性率均明显降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。Western blot检测结果显示,与对照组相比,H2O2组RIP3蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);与H2O2组相比,SS31+H2O2组、Nec-1+H2O2组RIP3蛋白表达上调作用显著减弱,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论SS31及Nec-1对H2O2诱导的ARPE-19细胞氧化应激损伤具有明显的保护作用。

肝靶向肽-抗肿瘤肽CSP-MDA-7/IL-24融合基因原核表达条件优化

目的:优化肝靶向肽-抗肿瘤肽(CSP-MDA-7/IL-24)在大肠杆菌中诱导表达的相关条件。方法:通过考察CSP-MDA-7/IL-24重组菌生长曲线,选择合适的诱导时机,通过SDS-PAGE检测CSP-MDA-7/IL-24蛋白的表达量,单因素分析诱导时间、培养基p H值、诱导温度和诱导剂IPTG浓度,在此基础上各选取5个水平进行正交实验,摸索最佳诱导表达条件。结果:培养基p H7.0、IPTG浓度0.12 mmol/L、培养温度42℃、诱导表达4 h为重组蛋白的最佳表达条件。结论:为进一步制备重组蛋白CSP-MDA-7/IL-24及评价其生物活性奠定了基础。

组织因子靶向肽对激光诱导小鼠脉络膜新生血管形成的抑制作用

目的探讨组织因子靶向肽(tissue factor targeting peptide,TF-TP)对激光诱导C57BL/6小鼠脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)形成的影响。方法选取36只清洁级C57BL/6雌性小鼠分为3组:正常对照组、激光组和TF-TP给药组。激光光凝后第1天开始,TF-TP给药组每隔1 d应用5μL微量进样器给予小鼠玻璃体内注射1μL浓度为100 mg·L^(-1)的TF-TP,共3次。通过FFA评价各组小鼠CNV渗漏情况;采用组织病理学方法观察光凝后14 d各组小鼠CNV中央最大厚度;采用免疫组织化学法测定视网膜脉络膜组织中CD34的表达;通过Western blot检测小鼠RPE-脉络膜复合物中TF蛋白的表达。结果激光组小鼠在光凝后14 d,视网膜光斑处可见明显荧光渗漏点,造影晚期呈弥漫性荧光扩散,总渗漏率为69.79%。TF-TP给药组小鼠视网膜光斑处可见轻度荧光渗漏,造影晚期可见渗漏处高荧光点但无扩散,总渗漏率为55.21%。TF-TP给药组的渗漏率低于激光组,差异有统计学意义(P=0.037)。TF-TP给药组CNV中央最大厚度为(60.02±2.48)μm,明显低于激光组(115.89±5.04)μm,差异有统计学意义(P<0.05)。TF-TP给药组视网膜脉络膜组织中CD34表达的A值为0.09±0.03,明显低于激光组(0.16±0.01),差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组、激光组、TF-TP给药组TF蛋白的相对表达量分别为0.14±0.01、0.40±0.02、0.22±0.03。TF-TP给药组TF蛋白的相对表达量明显低于激光组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 TF-TP可以减小激光诱导的小鼠CNV厚度,降低视网膜脉络膜组织中CD34以及RPE脉络膜混合物中TF蛋白的表达,抑制小鼠CNV的形成。

鼻咽癌靶向肽修饰的rES对鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响

目的探讨鼻咽癌靶向肽(NTP)修饰的重组人血管内皮抑素(rES)对鼻咽癌裸鼠移植瘤生长的影响,为鼻咽癌的靶向治疗提供新思路。方法合成pET-28a-rES与pET-28a-rES-NTP质粒,并通过大肠杆菌表达系统制备rES与rES-NTP重组蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(WB)鉴定重组蛋白。建立人鼻咽癌CNE1细胞裸鼠移植瘤模型,酶联免疫吸附试验检测重组蛋白注射后不同时间点在肿瘤组织中的含量。将致瘤成功的裸鼠随机分为对照组、rES组、rES-NTP组3组,3组分别隔日尾静脉注射100μL的生理盐水、rES重组蛋白(15 mg/kg)、rES-NTP重组蛋白(15 mg/kg),共给药4周。测量移植瘤的体积与重量;免疫组织化学染色法检测移植瘤中CD31的表达;荧光定量PCR、WB检测移植瘤中VEGF、HIF-1ɑmRNA与蛋白质的表达。结果rES与rES-NTP重组蛋白的理论分子量分别为22.48 kd、23.33 kd,经SDS-PAGE与WB鉴定正确。尾静脉注射后5 min、30 min、1 h、3 h、6 h时,rES-NTP组在肿瘤组织中的含量均高于rES组(P<0.05),而在注射后12 h时,两组差异无统计学意义(P>0.05)。rES-NTP组移植瘤的体积和重量受到明显的抑制,低于对照组与rES组(P<0.05)。rES-NTP组中的CD31、VEGF、HIF-1ɑ表达量均低于对照组与rES组(P<0.05)。结论rES-NTP重组蛋白具有较好的肿瘤靶向能力,能够有效抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤的生长,抑制血管生成,下调VEGF及HIF-1ɑ表达。

肝靶向肽修饰的人内皮抑制素rES-CSP融合蛋白可溶性表达及活性鉴定

为了方便获得大量的有活性rES-CSP融合蛋白,通过优化诱导表达条件,实现融合蛋白rES-CSP的可溶性表达,并纯化后检测其生物学活性,使该融合蛋白作为药用蛋白大规模生产成为可能。首先在常规条件下诱导表达融合蛋白rES-CSP,通过SDS-PAGE电泳分析,选出最优菌株;继而优化诱导温度和诱导时间,Western Blot检测目的蛋白可溶性表达情况,Ni-NTA亲和层析柱进行纯化后RP-HPLC分析其纯度;CCK-8细胞增殖实验和流式细胞仪检测融合蛋白生物学活性。结果选出目的蛋白约占菌体总蛋白43.84%的单克隆菌株为研究对象,在诱导温度为25℃,诱导时间为20 h时,融合蛋白rES-CSP实现可溶性表达,并且可溶性表达量较高。经纯化后获得的rES-CSP融合蛋白纯度达到98%以上;制备的rES-CSP融合蛋白具有抑制肝癌细胞HepG2增殖作用,且与HepG2结合能力较强;为融合蛋白rES-CSP的应用研究奠定基础。

脑靶向肽偶联药物研究进展

中枢神经系统(central nervous system,CNS)疾病严重危害人类的生命健康。但由于血脑屏障(blood-brain barrier,BBB)的存在,缺乏将药物输送到大脑的有效技术,这严重影响CNS疾病相关药物的开发成功率,致使治疗效果往往不尽如人意。因此,迫切需要一种新技术解决上述问题。脑靶向肽偶联药物由脑靶向肽、连接基团和有效载荷3部分组成,其利用生物相关的内源性转运机制使生物活性分子透过BBB,并到达脑实质,已成为一种有前景的CNS药物。本文简要介绍了脑靶向肽偶联药物中脑靶向肽、连接基团和有效载荷的种类及特征等,并列举了一些常见的脑靶向肽偶联药物,以及此类药物面临的挑战和改进的方法,以期为后续CNS药物的设计和开发提供新思路。

靶头修饰对PEG-PCL胶束在人宫颈癌细胞内转运行为的影响

目的 研究转铁蛋白靶向肽T7(7pep)对聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)胶束在人宫颈癌HeLa细胞内转运行为的影响。方法 以香豆素-6(C6)为荧光指示探针,通过薄膜分散法制备包载有C6的PEG-PCL(PEG-PCL-C6)胶束以及靶头7pep修饰的PEG-PCL(7pep-PEG-PCL-C6)胶束。比较两种胶束的粒径、多分散指数及外观形态;比较两种胶束被HeLa细胞实时摄取的情况及其入胞后与早期内吞体(EE)、内吞循环室(ERC)、晚期内吞体(LE)的共定位情况。结果 PEG-PCL-C6和7pep-PEG-PCL-C6胶束的平均粒径分别为(75.0±2.3)、(82.0±1.5)nm,多分散指数分别为0.17±0.20、0.17±0.32,外观均为规整的圆球形。7pep-PEGPCL-C6胶束的入胞速度和入胞量均明显快/多于PEG-PCL-C6胶束。7pep-PEG-PCL-C6胶束比PEG-PCL-C6胶束能够更快地进入EE,而入胞后PEG-PCL-C6胶束进入ERC的速率较7pep-PEG-PCL-C6胶束快,且PEG-PCL-C6胶束和7pep-PEG-PCL-C6胶束在LE均有逐渐累积的趋势,但7pep-PEG-PCL-C6胶束入胞60 min时与LE的皮尔森系数、信号重叠比率、共定位比率均显著低于入胞30 min时(P<0.05或P<0.01)。结论 靶头7pep修饰可提高PEG-PCL-C6胶束的入胞速率和入胞量,还可改变其胞内转运行为。

具有荧光探针的靶向肽/聚(醚-酰胺)制备及其肝癌细胞靶向性能研究

通过端氨基聚乙二醇PEG(Ⅰ)与二亚乙基三胺五乙酸二酐(DTPAA)开环合成新型端氨基聚(醚-酰胺)(PEG/DTPA)共聚物造影剂配体(Ⅱ)(Step1);Ⅱ的端氨基与偶联剂3-马来酰亚胺苯甲酸-N-琥珀酰亚胺酯(MBS)的活化端COOH反应,生成偶联剂/聚(醚-酰胺)MB/PEG/DTPA(Ⅲ′)(Step2);再通过Ⅲ′中MBS的CC双键与肝癌细胞靶向黏附肽FAM-AGKGTPSLETTPC-(SH)-COOH(FAM-13)上的巯基SH发生Michael加成反应(Step3),合成含有荧光探针FAM(5-carboxyfluorescein)的肝癌靶向肽/聚(醚-酰胺)(FAM-13/PEG/DTPA,Ⅲ).用1H-NMR和13C-NMR等方法对共聚物进行表征.Ⅲ对正常肝细胞L-02几乎观察不到荧光现象,而对肝癌细胞BEL-7404则有很强的黄绿色荧光,Ⅲ对肝癌细胞有很强的靶向性.大分子配体Ⅲ可望用于制备大分子造影剂及靶向载体负载药物.

肝靶向肽-人内皮抑制素融合蛋白表达条件的优化及活性鉴定

为了获得足够多纯度高且有活性的肝靶向肽-人内皮抑制素融合蛋白(HTP-r ES),首先研究了BL21/p ET21b-HTP-r ES重组菌株的生长曲线和最佳诱导时机;单因素分析不同p H值、不同诱导时间、不同诱导剂浓度、不同诱导温度时融合蛋白表达量;通过包涵体洗涤、复性、纯化,以获得高纯度的肝靶向肽-人内皮抑制素融合蛋白;最后采用流式细胞仪和MTT对融合蛋白进行活性鉴定。结果表明,BL21/p ET21b-HTP-r ES重组菌株在1.5–3.5 h处于对数生长期,培养基p H 8.0、IPTG终浓度0.06 mmol/L、42℃、诱导表达5 h为最佳表达条件。包涵体洗涤后纯度达60%,经复性、纯化后获得的目的蛋白纯度达到95%以上,对人肝癌细胞具有靶向性,能抑制人脐静脉内皮细胞的增殖。研究确立了融合蛋白最佳表达条件以及复性、纯化条件,为进一步研究其生物学活性及药物开发奠定基础。

致炎血管内皮细胞特异性靶向肽Nts-1的融合表达及其靶向性验证

目的构建致炎血管内皮细胞特异性靶向肽Nts-1的表达载体,表达、纯化融合蛋白,并对其靶向性进行初步验证。方法根据大肠埃希菌密码子偏好性,对Nts-1天然基因序列进行同义突变,并在Nts-1序列两端分别插入一个半胱氨酸使其环化后,克隆至p ET14b-EGFP载体中EGFP序列的C-末端,构建重组原核表达质粒p ET14b-EGFPNts-1,转化大肠埃希菌,IPTG诱导表达,表达的融合蛋白his-EGFP-Nts-1经纯化和SDS-PAGE鉴定后,用LPS致炎人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)体外验证其在细胞表面的亲和力。结果成功构建了p ET-14b-EGFP-Nts-1表达载体,纯化后的融合蛋白相对分子质量约32 000,纯度达95%以上。融合蛋白hisEGFP-Nts-1可特异性地靶向于致炎血管内皮细胞表面,其亲和力是由短肽Nts-1介导的。结论成功表达了融合蛋白his-EGFP-Nts-1,并初步验证了其对致炎血管内皮细胞的亲和力,为其生物化学活性及功能的研究奠定了基础。