靶向RNA:非药靶标研究的新机遇

制药产业历来一直注重发现以基因产物蛋白质为靶标的化合物 ,而对RNA组成的基因与蛋白质的中间产物研究甚少。以细菌rRNA为靶标的少数几种药用于临床已有半个多世纪。其中 ,以人类rRNA为靶标的氨基糖苷类抗生素在遗传病治疗方面已有所发展。RNA靶标是表达非药用蛋白质的经济方法 ,这是多年来积累的生物学知识为基础发展起来的高通量筛选方法所不能做到的。以非编码RNA序列为靶标的研究为药物发展提供了全新的机遇。本文介绍了靶向RNA的分类、特点及其在药物发现中的研究现状。

层黏素受体靶向RNA干扰在削弱直肠癌免疫逃逸中的作用探讨

为探讨层黏素受体(laminin receptor,LNR)靶向RNA干扰在直肠癌免疫逃逸中的作用,将pGenesil-3-shLNR重组质粒转染SW480细胞,对比干扰组、对照组和空载组细胞中LNR mRNA和蛋白表达情况。建立SW480细胞与人Jurkat细胞Transwell小室旁分泌共培养模型,检测共培养48 h后SW480细胞和Jurkat细胞的凋亡率,并检测2种细胞Fas、FasL、Caspase-8 mRNA和蛋白表达情况。结果显示,重组质粒转染效率为(65.30±6.03)%。与对照组、空载组比较,干扰组LNR mRNA和蛋白相对表达量均较低(P<0.05);SW480细胞凋亡率较高(P<0.05),Jurkat细胞凋亡率较低(P<0.05);SW480细胞Fas、Caspase-8 mRNA和蛋白相对表达量均较高,FasL mRNA和蛋白相对表达量较低,Jurkat细胞Fas、Caspase-8 mRNA和蛋白相对表达量均较低,FasL mRNA和蛋白相对表达量较高(P<0.05)。对照组与空载组LNR mRNA及蛋白相对表达量,SW480细胞和Jurkat细胞凋亡率,SW480细胞和Jurkat细胞Fas、FasL、Caspase-8 mRNA及蛋白相对表达量比较,差异均无统计学意义(P> 0.05)。以上结果提示LNR靶向RNA干扰可抑制直肠癌细胞中LNR表达,可能通过调节SW480细胞和Jurkat细胞中Fas/FasL信号通路使SW480细胞诱导Jurkat细胞凋亡率降低,同时增强Jurkat细胞杀伤SW480细胞能力,削弱直肠癌细胞的免疫逃逸能力。

以RNA为靶标的小分子药物的研究进展

目前临床上所使用的小分子药物大部分以蛋白为靶标,小分子药物通过与靶标蛋白上的特定位点结合而发挥药效。然而可成药的蛋白在总蛋白数中占据较少部分。“不可成药”蛋白占人体总蛋白的80%。因为大部分的蛋白并没有合适的药物结合位点。在中心法则中,RNA处于蛋白质的上游,控制着蛋白质的翻译,靶向RNA的小分子药物研究在一定程度上可以解决蛋白“不可成药”的难题。本综述文章总结了近年来靶向RNA小分子药物研究领域的代表性研究成果,以及靶向RNA小分子药物的筛选方法,并着重分析了靶向新冠病毒RNA的小分子药物的最新进展。

冷冻电子显微镜研究RNA结构的进展

核糖核酸(RNA)在生命的中心法则中扮演着承上启下的重要角色:它既携带遗传信息,又可以折叠成三维结构,在生命过程中发挥基因表达调控、催化化学反应等多种重要功能.例如,核糖体中的肽键生成反应完全由RNA催化完成.因此, RNA世界假说提出RNA早于DNA和蛋白质出现,作为生命起源的生物大分子.然而,相比于蛋白质,对RNA三维结构的研究还非常匮乏.在有限的RNA结构数据中,大部分是RNA与蛋白质的复合物(ribonucleoprotein, RNP).本文聚焦运用冷冻电子显微镜(冷冻电镜)对RNA三维结构与功能进行研究的最新进展,包括核酶、核糖开关和病毒因子等,阐明RNA结构研究的意义.同时比较了包括冷冻电镜、X射线晶体学、核磁共振等RNA结构解析方法的优势和挑战.最后展望该领域研究的基础和转化应用前景.

棘突蛋白氨基端嵌入标签(记)蛋白的重组猪流行性腹泻病毒的拯救和鉴定

【背景】猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea,PED)是严重影响养猪业健康发展的动物传染病,其致病原为猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)。PEDV结构蛋白之一——棘突蛋白(spike protein,S protein)负责病毒的侵染、入胞等过程,该蛋白结构和功能研究是PEDV分子生物学研究的热点。S蛋白分为两个功能域,N端的S1亚单位和C端的S2亚单位,以往研究表明PEDV DR13att毒株S1N(19-233 aa)结构域缺失,不影响DR13att毒株的存活和增殖。【目的】基于靶向RNA重组技术,在PEDV(DR13att)S1N结构域分别引入HA标签基因、抗坏血酸过氧化物酶(APEX2)基因,构建重组PEDV,考察S1N结构域能否被标签(记)蛋白或多肽替换。【方法】利用靶向RNA重组技术的PEDV反向遗传学操作平台,将转移载体p-PEDV-DR13att的S1N结构域(1-234 aa)分别替换成HA基因、APEX2基因,进行重组转移载体的构建,再分别将线性化的载体体外转录的RNA转染至m PEDV感染的LR7细胞,然后在Vero细胞上拯救重组PEDV。通过观察细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)、RT-PCR检测、测序、间接免疫荧光分析(immunofluorescence assay,IFA)、Western blotting检测对重组病毒进行验证,最后测定重组病毒滴度并绘制重组病毒生长曲线,探究重组病毒与亲本病毒的生长特性。【结果】构建的重组病毒经过拯救和传代,发现引入HA标签蛋白的重组猪流行性腹泻病毒r PEDV-DR13-S1N-HA(r PEDV-DSH)在P1代出现细胞病变,引入APEX2蛋白的重组猪流行性腹泻病毒r PEDV-DR13-S1N-APEX2(rPEDV-DSA)盲传至P4代,未出现细胞病变。对P4代的rPEDV-DSH、rPEDV-DSA进行RT-PCR检测、测序、间接免疫荧光分析、蛋白质印迹法验证,证实引入HA标签的重组病毒r PEDV-DSH拯救成功,而携带APEX2的重组病毒未能拯救成功。重组病毒rPEDV-DSH生长曲线表明rPEDV-DSH与亲本毒株DR13att有相似的生长趋势,但病毒增殖水平显著低于亲本毒株。【结论】HA标签替换S1N(1-234 aa)结构域的重组PEDV rPEDV-DSH成功拯救,为进一步研究S蛋白与宿主细胞的互作机制建立了基础。