应用RD-PCR技术制备基因芯片靶基因片段

应用RD -PCR技术分离SH -SY5Y细胞的基因片段。从正常培养的SH -SY5Y细胞中提取总RNA ,经oligo(dT)纤维素柱纯化分离出mRNA ,然后以oligo(dT1 8)为锚定引物反转录生成单链cDNA ,再以此为模板合成DNA的第二条链 ;将双链DNA经Sau3AI酶切之后 ,接上接头 ,经通用引物和选择性引物进行扩增 ;然后与载体pMD1 8-T相连 ,克隆鉴定、筛选、测序。所分离的cDNA片段经过扩增后用于制备基因芯片的靶基因 ,杂交检测的结果表明 ,此种方法所分离的基因片段可以用于基因芯片的靶基因片段 。

从单个细胞扩增靶基因片段的技术

目的 建立从人的单个细胞扩增特定靶基因片段进行基因诊断的技术。方法 利用显微操作技术挑取单个纤维母细胞 ,各置于 0 2ml簿壁反应管的裂解液中 ,合成针对抑癌基因P53第5～ 9外显子 (e)的引物 ,运用 1 5mer高度随机引物或一个特异引物进行单个细胞的整个基因组DNA或特异靶片段的预扩增 ,再以其为模板进行巢式聚合酶链反应 (PCR)扩增P53基因第e5～ 9的 1 90 0bp片段及含第 5 ,6外显子的 580bp片段。并用ABI 377测序仪测定其序列。结果 运用稀释至 0 0 1ng的基因组DNA扩增 1 90 0bp片段 ,优化PCR的条件。分别从 30个单个纤维母细胞扩增上述 1 90 0bp片段 ,1 0个获得 1 90 0bp片段 ,成功率为 33 %。扩增 580bp片段 ,则阳性率可达 60 %。序列分析证明确为人P53基因第 5 ,6外显子序列。结论 运用本实验室建立的技术可从人的单个细胞扩增特定靶基因片段 ,并测定其序列 。

通用PCR在皮肤感染性疾病诊断中的应用

通用PCR作为一种PCR相关的技术,通过针对不同种类病原体保守区基因的通用引物,能一次性扩增该组病原体的所有靶基因片段。结合其他的分子生物学技术,例如限制性酶切片段长度多态性分析及生物芯片技术,为医学病原体的分类与快速鉴定,尤其是临床传统培养难以培养的微生物和未知菌的鉴定提供了全新的方法。