靶序列富集多重PCR技术的发展及其应用

靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR,Tem–PCR)作为一种新型的分子生物学高通量检测技术,通过靶序列富集、靶序列加标签以及超级引物扩增3个阶段实现对靶标序列的大量扩增。靶序列富集多重PCR具有独特的反应过程,克服了常规多重PCR扩增条件不兼容、扩增具有偏爱性等缺点,实现了对同一反应体系多种病原的同步检测,为临床病原鉴别诊断、基因分型、耐药基因等领域的研究提供了新思路,具有较大的发展前景。笔者对Tem–PCR的研究背景、反应原理、技术应用及试剂盒开发等进行综述,旨在为Tem–PCR的研究和发展提供参考依据,为中国应对公共卫生危机提供新思路。

靶序列富集多重PCR-液相芯片联合检测4种常见呼吸道病毒的初步应用

目的呼吸道病毒是引起婴幼儿呼吸道感染的最主要病原体,为快速准确诊断其感染,文中建立一种基于液相芯片系统的4种常见呼吸道病毒快速分子检测方法,为有效防控其发生和流行提供有力手段。方法采集南京总医院儿科就诊的有急性呼吸道感染症状的患儿咽拭子标本120例及30例正常对照标本,分别纳入患儿组和对照组。针对A型流感病毒(Flu A)、B型流感病毒(Flu B)、呼吸道合胞病毒A型(RSVA)和B型(RSVB)的保守区序列分别设计并合成了特异性引物、探针和通用引物,构建4种病原体阳性参比品,通过对扩增和杂交条件的优化,建立了靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)和Luminex液相芯片(x MAP)技术相结合的检测系统,并对该检测系统进行了特异性、灵敏度评价。收集以急性上呼吸道感染为主要表现的患儿咽拭子标本,用上述建立的方法进行检测分析,分别与单病毒基因荧光定量PCR检测方法及x TAG液相芯片法进行比对检测。结果建立了Flu A、Flu B、RSVA和RSVB4种呼吸道病毒的特异性快速分子检测方法且灵敏度可达10拷贝/μL。用快速分子检测方法和单病毒基因荧光定量PCR法对120例疑似患儿咽拭子标本进行检测,快速法阳性检出率为31.7%(38/120),荧光定量法阳性检出率为29.2%(35/120)。经一致性检验分析提示2种方法一致性较强(k>0.7)。部分标本同时采用x TAG液相芯片试剂盒进行检测,经一致性检验分析提示2种方法一致性较好(k>0.6)。结论临床的初步应用证实了4种常见呼吸道病毒快速分子检测方法具备灵敏、特异、快速等优点,为临床早期、准确判断呼吸道感染的病原体提供实验依据。

靶序列富集多重PCR结合DHPLC同时检测5种食源性致病菌

目的建立同时检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌5种食源性致病菌的简便、灵敏的高通量方法。方法根据GenBank公布的5种致病菌的特异性靶基因序列,设计5对特异性引物,与通用引物连接构成复合引物。经过反应条件的优化,建立了5种致病菌的靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR,Tem-PCR)扩增方法,扩增产物采用变性高效液相色谱(denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)技术进行检测。结果采用Tem-PCR-DHPLC方法,检测48株试验菌株,未发现非特异性结果。对5种致病菌检测灵敏度,除金黄色葡萄球菌为620 cfu/mL外,其余都小于100 cfu/mL。对4种样品的检测结果与国家标准方法相符合。结论 Tem-PCR-DHPLC检测方法,相比传统多重PCR方法,能有效地解决引物扩增效率不均衡的问题,不需优化引物浓度,方法特异性强,灵敏度高,具有较好的实用性。

多重PCR靶向富集结合高通量测序在子宫内膜癌MMR基因突变筛查中的应用

目的探讨多重PCR靶向富集结合高通量测序在子宫内膜癌MMR基因的突变筛查中的应用。方法选择86例豫西地区子宫内膜癌患者的血液为研究对象,提取样本基因组DNA,应用多重PCR扩增技术靶向富集MMR基因的外显子序列,构建文库后采用高通量测序技术检测分析子宫内膜癌患者中的MMR基因突变情况,采用Sanger测序法验证高通量测序结果,并对有无家族史患者的复发例数、复发时间进行分析统计,对中位无瘤生存时间进行统计。结果86例样本中发生MMR基因突变的共有66例,总突变率为76.8%,共发现12种非同义单核苷酸变异(SNV)和2种同义SNV。Sanger测序验证结果与新一代高通量测序结果一致。随访结果表明,不同年龄段的中位复发时间差异无统计学意义(P>0.05);有家族史组复发率明显高于无家族史组(P=0.003);无家族史组、有家族史组中位无瘤生存时间分别为(52.33±0.58)月、(36.33±1.21)月,差异具有统计学意义(P<0.001)。结论多重PCR靶向富集结合高通量测序技术用于MMR基因的突变检测成本低、速度快、通量高,可用于对EC高风险女性的早期筛查,从而为EC临床规范化治疗提供更多资料。

SARS病毒特异性靶基因的多重PCR检测技术研究

本研究探讨了多重PCR技术在SARS病毒检测中的应用。根据香港中文大学在GenBank上公开发表的SARS病毒基因组cDNA序列,人工合成克隆特异性靶基因DNA片段,以此片段作为阳性样品,根据世界卫生组织推荐的进行单PCR与多重PCR检测分析。以单PCR法获得了121bp、182bp及302bp的靶基因片段3条;以二重PCR法获得了121bp+182bp、121bp+302bp与182b+302bp的靶基因片段组合;以二重PCR法获得了121bp+182bp+302bp的靶基因片段组合。结果表明:多重PCR技术可成功应用于SARS病毒的检测。

3种食源性致病菌Tem-PCR检测方法的建立

应用靶序列富集多重聚合酶链式反应（t arget-enriched multiplex-polymerase chain reaction,Tem-PCR）技术建立金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌3种食源性致病菌的快速检测方法。分别以金黄色葡萄球菌fem A基因、沙门氏菌inv A基因和志贺氏菌ipa H基因为靶基因,设计3对特异性引物,并与通用引物连接组成Tem-PCR引物,通过反应条件优化,建立了Tem-PCR检测方法。结果显示,建立的Tem-PCR方法特异性强,对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌的检测灵敏度分别为1.1×10^3、2×10^3 CFU/m L和1.2×10^3 CFU/m L。Tem-PCR检测方法有效地解决了传统多重PCR引物扩增效率不均衡的问题。

31个SNP位点多重PCR扩增和芯片分型技术的建立及其法医学应用

目的对SNP基因分型芯片在个体识别中的应用价值进行研究。方法根据SNP不同等位基因的序列设计探针,制成分型芯片。采用4个复合PCR体系,用末端标记了Cy5的引物进行复合PCR扩增,产物与寡核苷酸探针进行杂交,根据杂交产生的荧光信号值确定样品在各SNP位点的基因型。将这一方法应用于109份样本的分型,根据基因型分布统计分析31个SNP位点的法医学应用价值。同时,进行家系调查和方法灵敏度分析。结果方法的灵敏度为1ng;所检测的31个SNP位点的累积个体识别率为0.9999999999979(偶合率为2.13×10-12),二联体亲子鉴定中累积非父排除率为0.9609,三联体亲子鉴定中累积非父排除率为0.9970。家系调查的结果表明,这些位点等位基因由亲代向子代的传递符合孟德尔遗传定律。结论上述31个SNP位点为中高信息量位点,适用于法医学个体识别,可作为当前STR系统的补充。

应用单细胞多重PCR进行性别鉴定

目的 建立一种准确、快速、简便的在单细胞水平进行性别鉴定的技术。方法 应用多重PCR同时扩增单个活检细胞的Y染色体特异重复序列(DYZ1)及X染色体特异重复序列(DXZ1)。结果 4 0个淋巴细胞(XY)成功地扩增出DXZ1电泳带(316bp)和DYZ1电泳带(15 4bp) ,正确率为10 0 % ;4 0个淋巴细胞(XX)中有39个成功地扩增出一条DXZ1电泳带(316bp) ,正确率为98%。结论 采用DYZ1和DXZ1引物对单个细胞同时扩增进行性别鉴定是一种简单可靠的方法,可用于胚胎种植前诊断及无创性产前诊断。

用于多重PCR甲基化靶向测序的比对软件性能评估

多重PCR甲基化靶向测序数据尚缺乏针对性的比对软件。本研究评估了9种比对方案在处理多重PCR甲基化靶向测序数据时的性能,包括平均CPU运行时间、平均最大内存、平均比对率、F1分数、平均比对速率、比对未通过率和差异甲基化位点,以及比对率受亚硫酸氢盐转化率和测序错误率的影响。本研究建立了打分系统以综合评价比对方案的优劣,结果显示,排名前三的方案依次为Bismarkbwt2(8.098分)、BWA-meth(7.846分)和Bismarkbwt1(7.840分)。这三个方案的F1分数均为1.000,且在不同亚硫酸氢盐转化率和测序错误率下的比对率表现最优。此外,Bismarkbwt2还对应最多的差异甲基化位点和最低的比对未通过率,并在平均最大内存和平均比对率两项指标上表现良好。因此,本研究推荐Bowtie2模式下的Bismark作为后续搭建多重PCR甲基化靶向测序生物信息学分析流程的比对软件。

一种新型同时检测6种猪病毒病简化靶序列富集多重PCR的建立和初步应用

为建立一种新型同时检测6种猪常见病的方法,针对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪细小病毒(PPV)的保守基因,设计6对特异引物,在引物的5′端加上一段非同源性标签序列,再设计1对可识别标签序列的超级引物。通过优化反应条件,建立了6种猪常见病毒的简化靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)检测方法。灵敏度试验结果显示,该方法对PRV、JEV、CSFV、PCV2、PRRSV、PPV核酸的最低检测限度分别为4.36×103、2.21×103、2.69×103、3.18×103、2.63×104、3.12×104copies/L,而单重PCR检测的最低限度分别为1.3×101、2.59×102、8.03×101、3.29×101、2.65×101、2.45×102copies/L。该方法对54份临床样本的检测结果与国标单重PCR检测结果的一致性为94.9%。本试验建立的方法特异、灵敏、操作简便且成本低廉,对这6种猪病常见病原的同时检测有一定的参考意义。

多重RT-PCR快速检测禽流感病毒的研究

西北农林科技大学生物工程研究所陈思怀、湖北省农科院牧医研究所乔宪凤、华文君等6位科学工作者参考H1-H5；亚型禽流感病毒（AIV）的核蛋白（NP）基因序列以及H5、H6、H9亚型AIV血凝素（HA）基因，共设计4对引物，建立了2对引物扩增AIV的NP、HA基因的多重RT-PCR方法。应用此法分别对H5、H6、H9亚型AIV尿囊液RT-PCR。电泳。回收预期片段进行测序，并同Genebank的注册序列进行同源性分析。同时还对NDV、IBV、IBDV尿囊液以及3种亚型AIV尿囊液的2倍系列稀释样品进行检测。

应用Tem-PCR技术同时检测3种致病菌的研究

应用靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR,Tem-PCR)技术建立同时检测沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌、大肠埃希氏菌O157三种致病菌的高通量简易检测方法.实验分别以沙门氏菌的inv A基因、单核细胞增生李斯特氏菌的hly基因、大肠埃希氏菌O157 rfb E基因为靶基因,设计3对特异性引物,并与通用引物连接组成Tem-PCR引物,通过反应条件优化,建立了TemPCR检测方法.结果表明,建立的Tem-PCR方法特异性强,其检测灵敏度分别为沙门氏菌1.1×103CFU/m L、单核细胞增生李斯特氏菌5.6×102CFU/m L、大肠埃希氏菌O157 2.3×103CFU/m L.方法不需要优化调整各引物对的浓度,易于使用,有效地解决了传统多重PCR方法扩增效率不均衡的问题.

靶序列富集多重聚合酶链式反应在儿童细菌性肺炎病原体检测中的应用

目的分析靶序列富集多重聚合酶链式反应(Tem-PCR)在儿童细菌性肺炎病原体检测中的价值,为临床诊治工作提供客观研究依据。方法选取2015年6月-2016年6月212例社区获得性肺炎(CAP)患儿作为研究对象,采集所有纳入患儿的呼吸道深部吸引物,分别对其进行细菌培养和Tem-PCR检测。结果有123例患儿的呼吸道分泌物标本细菌培养检出病原菌,检出率为58.0%,共检出病原菌127株,其中,革兰阴性菌和革兰阳性菌分别占76.4%和23.6%,主要病原菌为流感嗜血菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌,分别占20.5%、14.2%、12.6%;有85例患儿的呼吸道分泌物标本Tem-PCR检测呈阳性,阳性率为40.1%,共检出105株病原菌靶基因,其中,流感嗜血菌、肺炎链球菌、鲍氏不动杆菌的比例最高,分别占40.0%、38.1%、10.5%;Tem-PCR检测对流感嗜血菌、肺炎链球菌、鲍氏不动杆菌、金黄色葡萄球菌等的诊断特异度均较高,对肺炎链球菌、铜绿假单胞菌的诊断敏感度和Youden指数均较高。结论 Tem-PCR检测在儿童CAP特定病原菌的早期诊断中具有一定的应用价值,可作为细菌感染性CAP病原学诊断的辅助手段。

4种常见呼吸道病毒快速分子检测方法的建立

目的建立一种基于液相芯片系统的4种常见呼吸道病毒快速分子检测方法,为有效防控其发生和流行提供有力手段。方法针对A型流感病毒(influenza A virus,FluA)、B型流感病毒(influenza B virus,FluB)、呼吸道合胞病毒A型(respiratory syncytial viruse types A,RSVA)和B型(respiratory syncytial viruse types B,RSVB)的保守区序列分别设计并合成了特异性引物、探针和通用引物,构建4种病原体阳性参比品,通过对扩增和杂交条件的优化,建立了靶序列富集多重PCR(target enriched multiplex PCR,Tem-PCR)和Luminex液相芯片(xMAP)技术相结合的检测系统,并对该检测系统进行了方法学评价。结果该检测方法可以特异性区分4种病毒的RNA靶标分子,检测下限均为10拷贝/μl。结论该种基于液相芯片系统的新方法灵敏度高、特异性好,为实现在临床呼吸道样品中同时快速检测4种常见呼吸道病毒提供了技术基础。

分子鉴别诊断领域的革命性技术——Tem-PCR

分子鉴别诊断由于其高效、快速的特点,在公共卫生领域和个体化医疗中将发挥越来越重要的作用。分子鉴别诊断需要敏感、特异、可靠的多重扩增技术作为支撑,靶序列富集多重PCR(Tem-PCR)正是这样一项技术,能在一个反应体系中同时对多种靶基因高度敏感和特异的扩增,为分子鉴别诊断在应对公共卫生危机、食品安全、病毒分型、细菌耐药性分析和个体独特型遗传背景检测等方面的应用带来革命性变化。

应用二次PCR技术提高体外基因扩增的效率

自1985年Mullis等创立PCR技术以来,作为一种基因研究的新方法,在传染病、遗传病、肿瘤及基因工程的诊断和研究等许多领域内得到广泛应用,是分子生物学研究技术的重大突破.PCR方法灵敏、特异、简便、快速,但实验受诸多因素的影响,可以造成非特异性扩增产物或扩增产物的产量不足等,使实验达不到预期结果.为此我们建立了PCR二次扩增方法,弥补了第一次扩增有时出现的缺陷,提高了扩增效率.

多重PCR方法同时鉴别人参、西洋参、三七

目的:建立一种能同时鉴别人参属人参、西洋参、三七3种药材的多重聚合酶链反应(PCR)方法。方法:通过分析人参、西洋参、三七psb A-trn H基因序列的差异设计了特异性引物对1,利用随机扩增多态性DNA(RAPD)分子标记技术筛选获得的特异性片段的基因序列,设计了特异性引物对2;优化了多重PCR鉴别体系并验证其耐受性和实用性。结果:构建的多重PCR鉴别体系能够成功地鉴别人参、西洋参、三七,人参样本可扩增出片段大小约为150 bp的特异性条带,西洋参样本可扩增片段大小出约为150 bp和400bp 2条特异性片段,三七样本可扩增出片段大小约为400 bp的特异性条带。结论:本多重PCR鉴别体系特异性好,可准确、可靠地鉴别人参、西洋参、三七。

应用多重PCR检测食品中SARS病毒靶基因的初步研究

以分子生物学方法——聚合酶链式反应(PCR)技术为基础,初步探讨了食品中SARS病毒靶基因片段的多重PCR检测技术。根据GenBank公开发表的SARS病毒基因组cDNA序列,人工合成克隆特异性靶基因DNA片段,以此片段作为阳性对照,并将其添加到罐装蘑菇、牛肉干、大豆、鱼干等食品的cDNA中作为阳性样品,再根据世界卫生组织推荐的引物序列合成引物,进行单PCR与多重PCR检测分析。结果表明:以单PCR法获得了121bp、182bp及302bp3条靶基因片段;以二重PCR法获得了121bp+182bp、121bp+302bp与182bp+302bp的靶基因片段组合;以三重PCR法获得了121bp+182bp+302bp的靶基因片段组合。检测灵敏度的实验表明:182bp片段的模板DNA量在0.003ng以上时,单PCR都能扩出清晰的条带,而121bp的靶基因片段只有模板DNA量在0.03ng以上时,单PCR才能扩出清晰的条带。它们的二重PCR分析的灵敏度与相应的单PCR分析灵敏度相同。

H5N1亚型禽流感病毒ns1基因修饰

目的:对H5N1亚型禽流感病毒株(A Qa ST85201)的ns1基因进行修饰并构建ns1基因的真核表达载体。方法:用RT PCR方法扩增A Qa ST85201的ns1基因,之后以扩增产物为模板,采用多重PCR技术对ns1基因进行修饰,将缺失的15个核苷酸片段插入ns1基因中,并将其克隆到真核表达载体,构建pcDNA3.1ns1重组质粒。结果:RT PCR产物测序显示,A Qa ST85201ns1基因开放阅读框全长678bp,编码225个氨基酸。构建的重组质粒经酶切鉴定和序列测定与预期相一致。结论:成功将缺失的15个核苷酸片段引入A Qa ST85201的ns1基因中,重组质粒的构建为NS1蛋白功能研究奠定了基础。