用于高通量测序的基因组靶序列捕获方法的建立

文章旨在建立一种基因组目标靶序列捕捉文库的方法,并结合第二代测序技术,以实现候选基因区段的深度测序。利用Agilent公司的eArray在线平台,对1250个基因的11824个外显子共2414977bp的基因组序列进行120个碱基长度的捕捉探针(钓饵)设计,并制备成SureSelect液相靶序列捕获试剂。选用2例人基因组DNA,超声打断后末端补平并磷酸化,连接SOLiD接头,回收150bp～200bp的DNA片段,与靶序列探针杂交捕获目标序列,油包水微乳滴PCR扩增后,磁珠分离富集,上SOLiD测序系统通过工作流程分析(WFA)进行文库质量的评价,或正式测序反应。结果显示对所包含的11147个基因外显子片段设计出并合成了46509个捕捉探针,制备成SureSelect试剂盒。探针可有效地捕捉并富集基因组DNA的目标靶片段,定量PCR显示富集效率可达29倍。WFA分析表明文库可以在SOLiD仪器进行正式测序。测序结果显示靶序列区域的测序数占有效总测序数的比例达到70%,覆盖率均在200×以上。结果表明本研究所建立的SureSelect基因组靶序列捕捉、富集建立测序文库的技术路线可行,可直接用于SOLiD测序仪的测序。

利用RNA捕获法在全基因组进行egfr启动子片段的富集

目的以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,egfr)启动子片段为目标靶序列,用RNA捕获法在全基因组进行靶序列的富集,结合第二代测序技术,实现候选基因区段的深度测序。方法本研究以宫颈癌细胞系HeLa S3 egfr启动子为模型,提取基因组后用MboⅠ酶切,补平加PE接头,回收400 bp～1000 bp的DNA片段作为模板,并用egfr启动子RNA与制备的基因组模板杂交将egfr启动子片段富集,富集的DNA片段PCR扩增15轮后用Solexa高通量测序。结果通过生物信息学技术分析,从实验组中随机取总条数为106 reads,比对到egfr启动子片段reads条数为1 889条,而比对到随机挑选的notch 1、pdgf-B、src基因reads条数分别为2、3、3条。从人类全基因组随机取总条数为106的等长reads作为对照组,比对到notch 1、pdgf-B、src、egfr基因reads条数分别为3,2,3,2条。在本实验中egfr启动子片段通过RNA捕获法被富集了630倍。结论用本研究建立的RNA捕获法进行基因组靶序列捕获、富集、测序文库建立的技术路线可行,所建DNA文库可直接用于Solexa测序仪的测序。RNA捕获技术与第二代高通量测序技术结合能应用于靶区域的重测序,研究可变剪切、核小体分布,发现和分析新的单核苷酸多态性(singlenucleotide polymorphisms,SNPs)位点,寻找许多复杂疾病相关基因及位点,针对性强,简便易行,节约成本。

一个甲基丙二酸血症家系致病基因的遗传学研究

目的对一个甲基丙二酸血症家系进行相关致病基因突变分析,从遗传学角度明确其可能的发病原因。方法采用二代测序(next generation sequencing,NGS)方法对该家系胎儿样本进行目标序列靶向捕获测序技术(targeting sequencing,TS)检测,检出可疑致病位点后再结合PCR和Sanger测序,在家系内进行遗传共分离验证以及反转录PCR验证。结果检测到先证者胎儿在MUT基因上携带母源性c.753+1delinsTGGTTATT变异和父源性c.911+1G>C变异,该家系符合常染色体隐性遗传的遗传规律,而MUT基因是甲基丙二酸血症的常见致病基因,两处变异可以导致MUT基因转录本的异常。结论MUT基因是该家系的可能致病基因,二代测序结合Sanger测序可以快速准确地对甲基丙二酸血症家系进行基因诊断,为该家系的遗传咨询和产前诊断提供可靠方法和依据。

41例5α-还原酶2型缺陷症患儿临床特点及SRD5A2基因突变分析

目的探讨41例5α-还原酶2型缺陷症患儿临床表型特点及SRD5A2基因突变类型。方法收集分析患儿临床资料,包括体格检查、病史、实验室检查、B超等;并提取患儿外周血基因组DNA,采用PCR扩增产物直接测序法或靶目的基因序列捕获二代测序法检测SRD5A2基因突变类型。结果41例患儿年龄从4个月至11岁不等,汉族。所有患儿染色体核型为46,XY,SRY基因检测结果阳性。病例临床主要表现为小阴茎和尿道下裂,其中单纯表现为小阴茎的有26例,占总病例人数63%;其余15例为尿道下裂合并小阴茎,占总病例人数37%。在39例患儿中检测到双等位基因突变,2例患儿只检测到1个等位基因突变。在41例患儿中,共检测出16种基因突变类型,其中c.725A>G(p.Tyr242Cys)、c.694C>G(p.His232Asp)和c.548-9T>G这3种突变类型为未报道过的新突变。在16种突变类型中,以c.680G>A(p.Arg227Gln)为主,占所有突变类型60%(48/80)。结论5α-还原酶2型缺陷症患儿临床表现以小阴茎或尿道下裂合并小阴茎为主;c.680G>A(p.Arg227Gln)突变是中国5α-还原酶2型缺陷症患儿SRD5A2基因的热点突变类型。