药物靶标的发现与验证技术研究进展

药物靶标的发现和验证是新药研发的第一步,也是药物筛选及药物定向合成成败的关键因素之一。随着基因组学、蛋白组学、生物信息学的快速发展,以及RNA干扰、噬菌体展示等新兴技术的出现,药物靶标的发现和验证技术日新月异。该文综述了在基因水平、转录水平、蛋白水平药物靶标发现和验证的各种技术的研究进展及其成功案例。

鸡miRNA-205b靶向调控CD24基因的双荧光素酶验证

miRNA靶基因预测软件发现,热稳定抗原分子24(CD24)基因是miR-205b的候选靶基因,为了进一步研究miR-205b在鸡热应激中的作用,将CD24野生型、突变型(CD24-WT/MT)和miR-205b mimic及mimic NC共转染DF-1细胞后,检测双荧光素酶活性。结果显示:当共转染CD24-WT时,miR-205b mimic组显著的抑制荧光素酶的活性,而共转染CD24-MT时,mimic NC组和miR-205b mimic组差异不显著。表明miR-205b能够靶向CD24的3′UTR区域,抑制其表达,结果为深入分析miR-205b在鸡热应激中的功能和作用机制奠定基础。

鸡miRNA lleett-7b靶向调控GHR基因的双荧光素酶验证

miRNA是一类大小约为22 nt的内源性非编码小RNA,通过与其靶基因mRNA相结合而影响其功能,进而调控动物的生长发育过程。miRNA靶基因预测软件发现,生长激素受体(GHR)基因是miRNA let-7b的候选靶基因之一。GHR基因作为生长激素基因的受体基因,在鸡的生长发育过程中具有极其重要的作用。试验采用双荧光素酶报告系统对其靶向关系进行验证。结果表明:GHR mRNA 3′UTR存在与let-7b相结合的靶标位点(UACCUCA);Let-7b过表达载体与GHR验证载体共转染组的荧光素酶相对活性只有0.159,明显下降,表明miRNA let-7b靶向负调控GHR 3′UTR,存在确切的靶标关系。研究结果可为进一步揭示let-7b介导GHR基因在鸡生长发育过程中的调控作用提供参考。

miR-R-203在鸡成肌细胞中靶向抑制EIFEIF4E基因表达的研究

为了进一步研究和探索mi R-203在鸡骨骼肌发育中的作用,本研究通过对mi R-203进行靶标预测,发现真核起始因子4E(EIF4E)基因的3′UTR区存在mi R-203的潜在靶标位点。通过构建连接有EIF4E 3′UTR和靶位点突变的EIF4E 3′UTR-MUT的双荧光素酶靶标验证载体,将其分别转染到已过表达mi R-203或阴性对照鸡的DF-1细胞中,检测其中的荧光素酶活性。结果显示,mi R-203能显著抑制EIF4E 3′UTR载体的荧光素酶活性,但不影响EIF4E 3′UTR-MUT载体的荧光素酶活性,mi R-203能靶向调控鸡EIF4E的表达,研究结果为深入分析miR-203在鸡骨骼肌中的功能和作用机制奠定基础。

HILIC-MS/MS法测定人尿中内源性糖类化合物浓度

目的:利用亲水色谱-质谱联用技术对人尿中15个内源性糖类化合物进行快速测定。方法:分别对色谱条件、质谱条件和样品前处理方法进行优化,最终以含内标的甲醇-乙腈(50∶50,v/v)为沉淀剂,按体积比5∶1加入到尿液中除杂,以含10 mmol·L^(-1)醋酸铵的水-乙腈(95∶5,v/v)和含10 mmol·L^(-1)醋酸铵的乙腈-水(95∶5,v/v)为流动相,梯度洗脱,样品经ACQUITY UPLC BEH Amide(2.1 mm×100 mm,1.7μm)色谱柱分离,在多反应监测(MRM)模式下,采用电喷雾离子化源、负离子扫描模式进行定量分析。结果:人尿中糖类物质线性关系良好,大部分糖类物质r>0.99,最低检测限在0.075~30 nmol·L^(-1)之间;日内、日间精密度范围分别为2.5%~7.6%和3.3%~7.3%,均小于15%;回收率范围为85.5%~115%;大部分化合物的基质效应在80%~120%之内,样品上清液4℃稳定性好,72 h内浓度变化范围为93.1%~106%,最终测得20例健康人尿液中各糖的含量分别为(平均值±标准误差):楝二糖(2 668.1±134.4)nmol·L^(-1),蔗糖(5 070.6±277.6)nmol·L^(-1),麦芽糖(15 214.5±442.5)nmol·L^(-1),麦芽三糖(849.7±42.6)nmol·L^(-1),葡萄糖(173 965.0±4 918.9)nmol·L^(-1),果糖(22 172.5±1 463.6)nmol·L^(-1),棉子糖(292.1±17.6)nmol·L^(-1),肌苷(2 083.5±93.4)nmol·L^(-1),腺苷(2 645.5±78.2)nmol·L^(-1),甘露糖醇(83 925.0±3 938.6)nmol·L^(-1),赤藓糖醇(375 805.0±12 094.6)nmol·L^(-1),阿拉伯糖醇(192 921.1±5 689.2)nmol·L^(-1),麦芽四糖、木糖和核糖均低于定量限(分别低于60、600和3 000 nmol·L^(-1))。结论:该方法能快速测定人尿液中15个内源性糖类化合物含量,对代谢组学后期的靶标验证、代谢机理研究等具有重要意义。