核酶在大肠杆菌内对烟草花叶病毒靶RNA的切割作用

把一段取自TMV RNA的靶cDNA序列连接在一个体内表达转录载体内的报道基因CAT起译密码子ATG的下游组成了读码框不改变的CAT融合基因,通过测定载体在大肠杆菌内表达的CAT活力变化,观察了与CAT同时表达的核酶在体内对靶序列的作用。当专一核酶RZ1、RZ1A或RZ1表达时,CAT的酶活力下降了30%,但非专一核酶RZ3的表达并不改变CAT活力。凝胶电泳和引物延伸结果表明CAT活力的下降是由于这些核酶对融合CAT mRNA在5’靶序列区发生了专一切割从而影响了蛋白的合成所致。

非编码RNA的靶RNA预测方法综述

非编码RNA(ncRNA)在人类基因转录本数目中占比很高,研究表明它们能在许多关键的生物学过程中发挥重要作用。目前只有极少数ncRNA通过实验证明具有明确的功能,大量ncRNA的功能依然未知。通过预测ncRNA的靶RNA进而增加对ncRNA功能和工作机制的深入了解变得日益重要。本文介绍了多种预测ncRNA靶RNA的生物信息学方法,概述了各个方法的主要算法思想以及其优缺点。最后,在总结分析现有算法的基础上,探讨了该领域的进一步研究方向。

CCR5,CXCR4双靶区反义RNA重组腺病毒载体的构建

目的 :构建趋化因子受体CCR5 ,CXCR4双靶区反义RNA重组载体并获取重组腺病毒以用于抗HIV 1基因治疗的研究 .方法 :用RT PCR法从健康人外周血单个核细胞中分别扩增出趋化因子受体CCR5 ,CXCR4 5′端翻译起始区 6 5 3bp和6 36bp的cDNA片段 ,将其反向插入腺病毒穿梭载体质粒pAd Track CMV中 ,再与包装质粒pAdEasy 1共转染BJ5 1 83细菌同源重组 ,卡那抗性培养基筛选阳性克隆 ;同源重组的载体用脂质体转染剂转染 2 93细胞包装、扩增 ,荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白 (GFP)以及PCR法鉴定、氯化铯密度梯度离心法纯化重组腺病毒 .结果 :成功构建了CCR5 ,CXCR4双靶区反义RNA重组腺病毒载体 ,并于 2 93细胞中包装、扩增得到高滴度的重组腺病毒 ,其滴度为 :7.2× 1 0 1 2 PFU/mL .结论 :CCR5 ,CXCR4双靶区反义RNA重组腺病毒的构建为研究双靶位辅助受体反义RNA抗HIV

hTERT和survivin双靶点RNAi表达载体的构建及对人结肠癌SW480细胞的抑制作用

目的构建人端粒酶反转录酶(hTERT)和生存素(survivin)基因表达的RNA共干扰载体,并检测其对人结肠癌SW480细胞中hTERT基因和survivin基因的干扰作用。方法根据Genbank提供的hTERT和survivin cDNA序列,设计、筛选出高效、特异性强的干扰序列,构建特异性干扰hTERT基因和survivin基因的重组体pGenesil-1.1-survivin、pGenesil-1.2-hTERT,酶切、测序鉴定正确后,两个重组体均用HindⅢ和BamHⅠ双酶切,将pGenesil-1.1-survivin回收大片段,pGenesil-1.2-hTERT回收小片段,将回收大、小片段用T4 DNA连接酶定向连接,即构建成重组体pGenesil1.1-survivin-hTERT。将3个重组体分别转染SW480细胞,RT-PCR检测细胞中hTERT和survivin基因表达水平,MTT检测对SW480细胞增殖的影响。结果构建的各质粒经限制性酶切及DNA测序均证明其质粒构建正确,RT-PCR检测hTERT和survivin基因表达水平明显降低(P<0.05),各干扰质粒重组体对细胞增殖有明显的抑制作用(P<0.05)。结论靶向survivin和hTERT基因的双干扰载体构建成功,为后续的结肠癌基因治疗研究奠定理论基础。

计算识别microRNA及其靶基因(英文)

小RNA的发现为基因调控系统研究提供了新的方向。在多数物种中已经发现了大量的小RNA。这一领域已经成为了近来研究的热点,在研究起始阶段,计算学方法已经成为实验研究中不可或缺的工具,许多发现是由生物学实验与计算学方法共同合作来完成的。总结了前人关于小RNA及其靶基因识别的理论知识,讨论了关于预测小RNA及其靶基因的计算学方法和相关软件。

小分子药靶——RNA药靶研究进展

对RNA药靶的特点、研究策略和针对RNA药靶的小分子药物筛选方法 ,进行了综述 .RNA的三级结构作为分子相互作用的识别位点和结合位点对RNA的生物功能的实现具有重要决定作用 。

CDK2干扰RNA新靶点的发现及对人脑胶质瘤生长的影响

目的:构建4个新靶点的人CDK2干扰RNA真核表达载体,转染人脑胶质细胞瘤SHG44细胞,经RT-PCR检测mRNA的表达MTT法检测细胞增殖,获得干扰效果最好的真核表达载体,为继续探讨CDK2在SHG44细胞中的作用提供有价值的资料及实验基础。方法:1.构建4个新靶点CDK2干扰RNA真核表达载体并用双酶切和测序鉴定。2.脂质体法瞬时转染上述4个载体到SHG44细胞株。3.通过RT-PCR比较转染后CDK2mRNA的表达量,MTT法检测细胞增殖。结果:1.成功构建了4个新靶点的CDK2干扰RNA真核表达载体PGPU6/GFP/Neo-CDK2-1、PGPU6/GFP/Neo-CDK2-2、PGPU6/GFP/Neo-CDK2-3、PGPU6/GFP/Neo-CDK2-4。2.CDK2 mRNA表达和细胞增殖明显受到抑制,并获得了效果最好的CDK2干扰RNA真核表达载体。结论:.成功构建并筛选出了效果最好的新靶点CDK2干扰RNA真核表达载体,使SHG44细胞的CDK2 mRNA的表达明显降低。

靶向RNA:非药靶标研究的新机遇

制药产业历来一直注重发现以基因产物蛋白质为靶标的化合物 ,而对RNA组成的基因与蛋白质的中间产物研究甚少。以细菌rRNA为靶标的少数几种药用于临床已有半个多世纪。其中 ,以人类rRNA为靶标的氨基糖苷类抗生素在遗传病治疗方面已有所发展。RNA靶标是表达非药用蛋白质的经济方法 ,这是多年来积累的生物学知识为基础发展起来的高通量筛选方法所不能做到的。以非编码RNA序列为靶标的研究为药物发展提供了全新的机遇。本文介绍了靶向RNA的分类、特点及其在药物发现中的研究现状。

LncRNA的靶RNA预测研究

长链非编码RNA(lncRNA)不具有编码蛋白能力,但在各种重要的生命过程中起着关键的调控作用。迄今为止,已证实具有明确调控功能的lncRNA极少,通过计算方法预测lncRNA靶RNA,根据靶RNA功能预测lncRNA调控功能已成为lncRNA研究的一个重要方向。本文主要综述预测lncRNA靶RNA研究的相关进展,总结各种主流预测模型的算法流程及其优缺点,探讨该领域的发展方向。

信使RNA药物修饰及其递送系统研究进展

信使RNA(mRNA)药物在多种疾病的预防和治疗中展现了巨大的应用价值。最大程度提高mRNA的稳定性和翻译效率,保证mRNA免受核酸酶的降解并靶向特定组织和细胞是临床转化的要求。通过修饰核苷酸降低mRNA免疫原性,密码子优化增加mRNA翻译效率,5'帽结构和3'多聚腺苷酸尾结构增加mRNA稳定性,以及添加5'和3'非翻译区功能调控mRNA稳定性和翻译效率。通过纳米粒递送系统保护mRNA不被核酸酶降解,增加mRNA血液循环,并帮助mRNA进入细胞质发挥治疗和预防作用。本文综述了mRNA药物的制剂工程技术进展,讨论了提高mRNA稳定性和翻译效率的方法及设计原理,总结了具有产业转换潜力的mRNA递送系统的设计要求及其临床应用,并展望了mRNA药物未来可能的研究方向,以满足实现个性化精准医疗的需求。

siRNA介导的基因沉默

siRNA(small interfering RNA)介导的基因沉默是细胞内监控寄生的遗传物质、沉默无用的信息模板和调节自然的时空转换的一种分子机制。它与体液免疫和细胞免疫一起形成了动物和人类机体中免疫系统的三大支柱,从不同水平上来对抗体内外有害物质的干扰和侵犯。现已清楚,大约22个核苷酸长的双链RNA能够通过不同途径,以序列特异的方式来高效地沉默含有同源序列的靶RNA分子。这一古老而又迷人的系统现已被公认为是鉴定基因功能、调控基因表达和改变基因表型的简单而有效的方法。可以预计,这一新颖的技术在不远的将来必将形成一条研究功能基因组学、探索信号通路和创造遗传缺陷模型的高速公路,并将开创一条预防和治疗人类疾病的新途径。

反义RNA

1981年美国NIH的Tomizawa在细茵中发现了一种新的RNA分子,即反义RNA。反义RNA是指其核苷酸序列可以与其靶RNA(主要是mRNA)互补杂交产生双链RNA,影响靶RNA的正常加工修饰、翻译等过程,从而调控基因的表达的一类RNA分子。后来的研究均证明在原核生物中普遍存在这种RNA。1984年,Izant和Weitraub将这种RNA定义为反义RNA。随后,1986年Williams发现,在真核生物细胞中也存在自然的反义RNA。

鸭源PKCI miRNA表达载体的构建及鉴定

为给蛋白激酶C抑制蛋白（PKCI）在鸭肠炎病毒增殖的作用机制奠定基础,根据PKCI基因mRNA序列及miRNA设计原则,合成4对miRNA寡聚单链DNA,退火成双链dsDNA,用载体构建试剂盒进行重组质粒构建,插入miRNA表达载体（pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR）构建表达质粒,转化至感受态细胞DH5α,筛选并提取重组质粒进行测序分析。结果表明：在含壮观霉素的LB平板可生长出含目的基因的重组细菌菌落;测序表明成功构建了鸭源PKCI基因miRNA表达载体,重组质粒pSilencer-PKCI-1～pSilencer-PKCI-4的插入部分大小为71～134bp、68～131bp、68～130bp和68～131bp;重组质粒miRNA有鼠类miR-155骨架结构,即左侧为天然miR-155结构,右边为发卡结构的末端环区（internal loop）和配对区域内部的末端环区miRNA结构。

Notch1 siRNA对小鼠恶性黑色素瘤细胞体内外增殖的抑制作用研究

目的探讨靶向Notch1基因小干扰RNA(Notch1 siRNA,以下简称siNotch)对小鼠恶性黑色素瘤细胞体内外增殖的抑制作用。方法将siNotch转染小鼠恶性黑色素瘤细胞株B16F1,诱导RNA干扰,采用RT-PCR、Western blot、MTT法及细胞克隆试验体外检测细胞Notch1基因和蛋白表达及细胞增殖、克隆形成变化。随后分别将转染及对照细胞皮下接种于同基因C57BL/6小鼠(分别为转染组及对照组),在成瘤过程中瘤内注射相应siNotch1,记录肿瘤生长情况并绘制生长曲线,处死动物后取肿瘤比较各组肿瘤体积,并行HE及免疫组化染色观察肿瘤组织病理学变化和Notch1蛋白表达情况。结果 siNotch1转染B16F1细胞后,细胞增殖能力、克隆形成率及小鼠体内成瘤等均受到抑制(P<0.01),免疫组化显示转染组Notch1蛋白表达阳性细胞百分比明显低于对照组(P均<0.01)。结论 siNotch1可降低细胞Notch1的表达,从而抑制小鼠MM细胞的增殖与生长,可作为治疗恶性黑色素瘤的新方法。

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及其在RNA编辑中的潜在应用

化脓链球菌里的CRISPR-Cas9系统作为基因编辑工具已经得到广泛的应用。现有研究表明这个系统具有作为通用核酸识别技术的潜在价值,即Cas9系统也能靶向识别活细胞中的RNA。将RCas9与不同的蛋白因子融合,可能会实现基因表达调控、控制RNA的定位、改变RNA的组成和使RNA可视化等。在介绍CRISPR-Cas9系统介导的免疫机制的基础上,重点比较了RCas9和先前的RNA研究方法,从转录动力学、再生医学以及合成生物学等方面,综述了其潜在的应用价值,并对该系统在未来生命科学研究的应用进行了展望,以期为CRISPR-Cas9系统在RNA编辑方面的研究提供参考。

动物MicroRNAs的研究进展

MicroRNAs(miRNAs)是一类小的、内源的、非编码的RNA家族,其在转录后水平上对基因表达进行调控。miRNAs是在研究秀丽新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)发育转变过程中发现的,最初称为stRNAs(smalltemporal RNA,小时序RNA),但stRNAs只是miRNAs家族的一部分,随后在线虫、植物和哺乳动物中发现了miRNAs家族的数百个成员。动物miRNAs不仅在发育调控中起重要作用,还参与许多重要的生理过程。本文综述了动物中miRNAs的发现历程、生物学起源、作用机制、生物学功能、研究方法,并对动植物miRNAs的特点进行了比较。

L-精氨酸转运体-2的siRNA表达载体的构建及鉴定

目的:构建氨基酸转运体-2(CAT-2)的靶向小分子干扰RNA(siRNA)表达载体质粒,并测序鉴定,为下一步研究靶向siRNA对CAT-2蛋白表达和L-argine/iNOS/NO通路的影响建立基础。方法:根据L-精氨酸转运体CAT-2的mRNA序列及siRNA设计原则,并经BLAST比对,设计合成4对siRNA寡聚单链DNA,退火成双链dsDNA,用载体构建试剂盒BLOCK-iTTMPol II miR RNAi Expression Vector Kit with EmGFP进行重组质粒构建,将4对dsDNA分别插入到siRNA表达载体pcDNATM6.2-GW/EmGFPmiR中,构建4个siRNA表达质粒,并转化至感受态细菌DH5。筛选阳性克隆并提取重组质粒后测序分析。结果:CAT-2的siRNA重组载体质粒测序结果证实表达载体构建成功。结论:L-精氨酸转运体CAT-2 siRNA表达载体质粒成功构建,为下一步研究靶向siRNA对CAT-2蛋白表达和L-arg/iNOS/NO通路的影响建立基础。

基于RNA疗法在动脉粥样硬化性心血管疾病血脂管理的研究进展

血脂异常,如低密度脂蛋白胆固醇和甘油三酯升高或高密度脂蛋白胆固醇降低等,是动脉粥样硬化性心血管疾病发生和发展的重要危险因素。尽管他汀类药物是预防心血管疾病的主要药物,但依然存在心血管疾病残余风险。基于RNA的治疗可提供更有效的治疗选择。其优势在于药物靶向RNA的高度特异性区域,进而调节脂质和脂蛋白的代谢。目前,N-乙酰半乳糖胺结合RNA靶向药物抑制关键调节蛋白(如前蛋白转化酶枯草溶菌素9、载脂蛋白CⅢ、脂蛋白a和血管生成素样蛋白3)翻译,在血脂管理中显示出其独特的疗效,显著改善动脉粥样硬化性心血管疾病的预后。现对主要的靶向RNA治疗策略、目前临床研究现状和未来的前景进行综述。

LncRNA TP53TG1通过miR-96/TPM1轴调控胃癌细胞对5-FU的耐药性研究

目的探究长链非编码RNA(LncRNA)肿瘤蛋白P53靶基因1(TP53TG1)/微小RNA-96(miR-96)/原肌球蛋白1(TPM1)对胃癌细胞5-氟尿嘧啶(5-FU)耐药性的影响及其可能机制。方法体外培养SGC7901、SGC7901/5-FU细胞,将SGC7901/5-FU细胞分为对照组、TP53TG1 NC组(转染TP53TG1 NC)、TP53TG1 mimic组(转染TP53TG1 mimic)、miR-96 NC组(转染TP53TG1 mimic、miR-96 NC)和miR-96 mimic组(转染TP53TG1 mimic、miR-96 mimic)。UALCAN数据库分析胃腺癌组织、正常胃组织中TP53TG1表达差异;qRT-PCR法检测LncRNA TP53TG1、miR-96、TPM1 mRNA表达;CCK-8法、流式细胞术、蛋白质印迹法分别检测细胞增殖、凋亡及TPM1、Bcl-2、Bax蛋白表达;双荧光素酶实验检测miR-96、TPM1的靶向关系。结果胃腺癌组织中TP53TG1水平显著低于正常胃组织,差异有统计学意义(P<0.05)。与SGC7901细胞相比,SGC7901/5-FU细胞中LncRNA TP53TG1表达显著降低,miR-96表达显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。与TP53TG1 NC组相比,TP53TG1 mimic组SGC7901/5-FU细胞中LncRNA TP53TG1、TPM1 mRNA、TPM1蛋白、Bax蛋白水平及细胞凋亡率显著升高,miR-96、Bcl-2蛋白水平及细胞吸光度(A)值显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05);与miR-96 NC组相比,miR-96 mimic组SGC7901/5-FU细胞中LncRNA TP53TG1、TPM1 mRNA、TPM1蛋白、Bax蛋白水平及细胞凋亡率显著降低,miR-96、Bcl-2蛋白水平及细胞A值显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。miR-96与TPM1在SGC7901/5-FU细胞中存在靶向关系。结论LncRNA TP53TG1可通过miR-96/TPM1轴降低胃癌细胞对5-FU的耐药性。