白细胞介素18、单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因联合修饰骨髓间充质干细胞治疗脑胶质瘤

目的了解骨髓间充质干细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)联合转染单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因(HSV-tk)和白细胞介素18(interleukin-18,IL-18)后在荷瘤大鼠体内的治疗作用。方法提取1周龄大鼠骨髓培养大鼠骨髓间充质干细胞。骨髓间充质干细胞转染单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因(BMSCs/tk)或白细胞介素18(BMSCs/IL-18)或联合转染单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因、白细胞介素18(BMSCs/tk/IL-18),而后进行体内外试验检测其抗肿瘤作用。检测荷瘤鼠脾脏淋巴细胞免疫活性,采用TUNEL方法检测胶质瘤内的凋亡细胞,抗-CD34染色检测微血管密度(MVD),检测淋巴细胞的浸润,记录试验大鼠的生存期。结果骨髓间充质干细胞可稳定转染IL-18及tk基因,BMSCs/tk和BMSCs/IL-18/tk均显示了明显的旁观者效应,荷瘤鼠移植BMSCs/IL-18或BMSCs/IL-18/tk后,血清白细胞介素2和干扰素-γ浓度明显增高,并且接受移植的荷瘤鼠再次受到C6细胞冲击后可诱导快速的抗肿瘤免疫反应。微血管密度检测显示,BMSCs/IL-18(4.50±2.19)、BMSCs/tk/IL-18(3.65±2.13)与对照组(7.15±2.11)、PBS组(7.55±1.64)、BMSCs组(7.80±2.28)、BMSCs/tk组(7.65±1.84)比较有明显低的微血管密度(P<0.05),通过TUNEL检测、浸润淋巴细胞计数、细胞因子浓度及荷瘤鼠生存期比较,BMSCs/IL-18/tk比BMSCs/IL-18或BMSCs/tk显示了更加明显的抗肿瘤作用,BMSCs/IL-18/tk组生存期明显延长。结论联合转染单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因和白细胞介素18的骨髓间充质干细胞显示了明显的抗恶性胶质瘤作用,骨髓间充质干细胞可能成为一种理想的治疗颅内胶质瘤的基因治疗载体。

腺病毒载体介导的单纯疱疹病毒—胸苷激酶基因杀伤人膀胱癌细胞的实验研究

目的探讨HSV-tk/GCV系统基因治疗膀胱癌细胞的方法及结果。方法与结果采用了带有CMV启动子驱动HSV-tk基因的重组腺病毒载体,体外转染HTB9细胞后对GCV敏感性增强。当MOI=100时,HTB9细胞的IC50为2.5mg/L,病毒浓度降低,GCV对细胞的杀伤效率亦降低。将不同比例的tk+细胞和tk-细胞混合后加入10mg/L GCV,发现HSV-tk/GCV系统有很强的“旁观者效应”。结论HSV-tk/GCV系统是一种有效、安全地治疗膀胱癌的新方法。

逆转录病毒介导的HSV-TK基因对人骨肉瘤细胞的杀伤作用

目的 探讨骨肉瘤基因治疗的可行性。方法 采用逆转录病毒介导的HSV -TK基因转移和GCV治疗的方法进行研究。结果 成功构建含HyTK基因的重组逆转录病毒载体DORHyTK ;采用DOTAP将其转入PA3 17细胞中进行包装 ,筛选 ,并进行病毒滴度测定、收获病毒上清体外感染骨肉瘤细胞株OS73 2和SAOS -2。分别用PCR和RNA斑点杂交的方法证明假病毒中不含有复制活性病毒 ,HSV -TK基因已整合到宿主细胞基因组中 ,并获得表达。MTT比色法测定结果显示GCV对OS73 2TK和SAOS -2TK细胞均有明显的杀伤作用 ,且前者强于后者。旁观者效应在高细胞密度接种条件下强于低细胞密度 ,在SAOS -2细胞中的作用强于OS73 2。结论 HSV

单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因转染骨髓基质干细胞治疗大鼠脑胶质瘤

目的 研究转染单纯疱疹病毒-胸苷激酶（HSV-tk）基因的骨髓基质干细胞（BMSCs）对大鼠脑胶质瘤的治疗作用。方法 原代培养BMSCs，AdCMV-tk转染BMSCs。逆转录-多聚酶链反应（RT-PCR）检测BMSCs／tk对tk基因的转录。以BrdU标记BMSCs／tk，观察其趋瘤性。四甲基偶氮唑盐（MTr）法检测其对C6细胞的旁观者效应。将BMSCs／tk注入脑胶质瘤大鼠肿瘤对侧脑组织，原位末端标记（TUNEL）法检测脑内肿瘤细胞凋亡，动态MRI监测肿瘤体积的变化，观察荷瘤鼠生存期。结果全骨髓细胞培养法可获得纯化的BMSCs。感染AdCMV-tk 21d后，BMSCs仍有明显的tk基因表达。转染tk基因后的BMSCs仍具有明显的趋瘤性。BMSCs／tk不仅在体外可产生明显的旁观者效应，在荷瘤鼠脑内也显示了明显的诱导肿瘤细胞凋亡的旁观者效应，凋亡阳性率为20．38％±2．57％，与BMSCs组（2．56％±0．52％）和对照组（2．74％±0．38％）相比，差异均有统计学意义（P值分别为0．023和0．025）。BMSCs／tk移植3周时，BMSCs／tk组、BMSCs组和对照组肿瘤体积分别为（8．28±2．64）、（134．51±16．37）和（147．22±31．05）mm^3，BMSCs／tk组远小于BMSCs组（P=0．001）和对照组（P〈0．01），并且部分大鼠脑内肿瘤消失。BMSCs／tk组大鼠生存期为（52．60±13．11）d，与对照组相比明显延长（P=0．01）。结论 HSV-tk转染的BMSCs可能成为脑胶质瘤治疗的有效手段。

腺病毒载体介导的胞嘧啶脱氨酶/单纯疱疹病毒-1-胸苷激酶双自杀基因对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 观察构建的含胞嘧啶脱氨酶 /单纯疱疹病毒 - 1-胸苷激酶 (CD TK)双自杀基因的重组腺病毒对血管平滑肌细胞 (VSMCs)增殖的影响。方法 将含CD TK单、双自杀基因的重组腺病毒感染培养至 3～ 5代的大鼠VSMCs。荧光显微镜观察报告基因绿色荧光蛋白的数量确定感染效率。用MTT法检测前体药物对各转基因组细胞增殖的抑制作用。结果 单、双自杀基因组腺病毒均可 10 0 %感染VSMCs。当感染复数 (M O I)为 10时 ,双自杀基因组靶细胞的存活率仅 10 % ,明显低于腺病毒 (Ad) TK(43% )和Ad CD(6 4 % )单基因组 (P <0 0 5 )。当M O I≤ 2 0时双自杀基因能够对细胞产生最大 (90 % )杀伤而CD、TK单基因组和单基因共转染组则不能 ,而且双基因组所需前体药物的浓度 (无环鸟苷 0 1μg ml,5 氟胞嘧啶 10 μg ml)低于单基因组 (无环鸟苷 0 5 μg ml,5 氟胞嘧啶 5 0 μg ml)。双基因组的TK或CD基因单独作用时对细胞的抑制作用接近或低于相应的单基因组。结论 双自杀基因共表达腺病毒载体对VSMCs的抑制作用、安全性及可调控性均优于单基因。

重组单纯疱疹病毒-胸苷激酶和人白介素-2基因痘苗病毒真核表达载体的构建

目的 构建含单纯疱疹病毒 胸苷激酶 (HSV tk)和人白介素 2 (hIL 2 )基因的痘苗病毒真核表达载体 pMJ6 0 1,为进一步实施胃癌的基因治疗作必要的准备。 方法 利用目的基因与载体的连接、感受态细胞的制备及转化、质粒抽提、琼脂糖凝胶电泳、酶切、DNA序列分析等多种基因工程技术 ,将纯化回收的HSV tk和hIL 2分别与 pMJ6 0 1进行连接、转化并鉴定。 结果 分别用BamHⅠ HindⅢ和SalⅠ BamHⅠ酶切位点 ,将HSV tk与hIL 2DNA成功地克隆到pMJ6 0 1真核表达载体上。结论 重组HSV tk +hIL 2基因 pMJ6 0 1的构建 ,为进一步研究胃癌的基因治疗打下坚实的基础。

经肝动脉或瘤体注射单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因治疗兔肝癌

目的 观察瘤体内直接注射或经肝动脉注射载有单纯疱疹病毒胸苷激酶 (HSV TK)基因的EB病毒表达质粒 pDR2 /TK、丙氧鸟苷 (GCV )对原位兔肝癌的治疗效果。 方法 制作兔原位肝癌模型 (VX2 ) ,瘤体注射或经肝动脉注射质粒 pDR2 /TK ,腹腔注射GCV连续 10d。RT PCR检测肝癌HSV TK表达 ;螺旋CT监测肝癌大小 ,并观察兔存活时间。结果TK基因导入 10d后 ,直接注射组TK在肝癌组织强表达 ,癌旁组织弱表达 ,正常肝组织不表达 ;肝动脉注射组TK基因在肝癌表达稍强于癌旁及正常肝组织。直接注射组肿瘤大小 ( 3 .5 5± 0 .3 9)cm ,与经肝动脉注射+肝动脉结扎组肿瘤大小 ( 3 .70± 0 .3 7)cm无明显差别 (P >0 .0 5 ) ,但均明显小于对照组。瘤体直接注射TK基因 +GCV治疗组动物平均存活时间 ( 5 9.8± 3 .3 )d、肝动脉注射组 +肝动脉结扎组( 5 4.8± 4.5 )d明显长于各对照组 (P均 <0 .0 1)。结论 对实验性兔肝癌 ,瘤体内直接注射或经肝动脉注射导入治疗基因后 ,HSV TK/GCV系统具有较好的治疗效果。

单纯疱疹病毒1-胸苷激酶报告基因显像研究进展

放射性核素报告基因显像技术作为监测基因治疗表达的一种有效手段，是目前研究的热点。报告基因系统主要有三类，其中酶的报告基因系统中的单纯疱疹病毒1-胸苷激酶由于其良好的理化特性，适合作为报告基因而对其进行了深入、广泛的研究，它的两类底物是嘌呤核苷衍生物和无环鸟苷衍生物，目前已经用不同放射性核素进行标记而达到显像目的。

AdCMV-TK和AdCMV-p53联合治疗胶质瘤的体外实验

目的 为了探讨联合应用单纯疱疹病毒 胸苷激酶和野生型p5 3两种基因治疗胶质瘤的可能性。方法 构建了含CMV启动子和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因 (HSV TK)的重组腺病毒AdCMV TK和含CMV启动子及野生型p5 3的重组腺病毒AdCMV p5 3。以感染复数 (MOI)为 1 0 0的病毒剂量 ,用AdCMV TK和AdCMV p5 3同时感染人胶质母细胞瘤细胞系TJ90 5 ,并以 1 0 0MOI的AdCMV TK和AdCMV p5 3分别感染另外两组TJ90 5细胞。除感染AdCMV p5 3的细胞外 ,其他两组均于感染后加入 1 0 0 μmol/LGCV。 结果 感染AdCMV p5 3的TJ90 5细胞 ,其生长受到抑制 ,于感染后第 5d,细胞存活率下降为 3 6 9% ,感染AdCMV TK的细胞 ,其生长抑制程度与感染AdCMV p5 3的TJ90 5细胞相似 ,用药后第 5d ,细胞存活率为 3 0 1 % ,而同时感染两种重组腺病毒的细胞 ,细胞生长的抑制程度更明显 ,应用 1 0 0μmol/LGCV后第 5d,细胞存活率仅为 8 8%。结论 联合应用AdCMV TK和AdCMV p5

融合自杀基因抑骨肉瘤生长的实验研究

目的观察单纯疱疹病毒-胸苷激酶/胞嘧啶脱氨酶融合自杀基因(HSV-TK/CD)对骨肉瘤细胞增殖的影响和对裸鼠骨肉瘤生长的影响。方法将含TK/CD的重组腺病毒载体感染人骨肉瘤细胞系MG-63细胞,测定感染效率后分别给予不同浓度的前体药物和不同感染复数的自杀基因重组腺病毒作用于瘤细胞,测定细胞A值计算瘤细胞增殖抑制率,MTT法测定细胞存活率,并用流式细胞术和Hochest33342染色法分析其杀伤机制;人骨肉瘤细胞系MG-63细胞于裸鼠成瘤后将其分为6组(每组8只):PBS对照组(A组);重组腺病毒(Ad)-Lac-Z/GCV+5-FC组(B组);Ad-TK/GCV组(C组);Ad-CD/5-FC组(D组);Ad-TK/GCV+Ad-CD/5-FC组(E组);Ad-TK-CD/GCV+5-FC组(F组)。各组经治疗后观察肿瘤的生长状况及组织病理学改变。结果含自杀基因的重组腺病毒成功感染MG-63细胞;不同感染复数和不同前体药物浓度下,融合自杀基因系统对瘤细胞的杀伤作用明显强于单基因作用和双基因相加的作用,且有显著性差异(P<0.05);杀伤机制为致细胞坏死和细胞凋亡。裸鼠实验中,B组与A组比较,肿瘤体积与肿瘤坏死程度无明显差异(P>0.05);与A、B组相比较,C～F组肿瘤的生长均受到明显抑制(P<0.05),且E、F组与C、D比较有显著性差异(P<0.05)。结论融合自杀基因HSV-TK/CD对骨肉瘤细胞系MG-63细胞和裸鼠骨肉瘤的生长均有明显的抑制作用。

HSV-TK/GCV自杀基因系统联合γ射线放射治疗宫颈癌的实验研究

目的探讨HSV-TK/GCV自杀基因系统协同60Coγ射线放射治疗对人宫颈癌细胞系的体内外联合杀伤作用,以及HSV-TK/GCV对放射治疗的增敏作用。方法分别以HSV-TK/GCV6、0Coγ射线放射治疗及两者联合治疗人宫颈癌HeLa细胞系和裸鼠宫颈癌移植瘤模型,比较治疗效果;利用增敏效应比值(E/O)、克隆形成实验评价体内外HSV-TK/GCV对放射敏感性的影响。结果在体外实验中,自杀基因对宫颈癌HeLa细胞生长的抑制率为45.8%,单纯放疗的抑制率为42.4%,而基因治疗与放疗联用的抑制率为87.5%,与前两者比较,差异有统计学意义(P<0.01);且联合治疗组对射线敏感性较单独治疗组明显增加,克隆形成率明显下降(P<0.05);在体内实验中,单纯基因治疗与放疗对HeLa细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑瘤率分别为39.5%和35.8%,而基因治疗放疗联用的抑瘤率达到87.9%,与前两者比较,差异均有统计学意义(P<0.01);增敏效应比值(E/O)为3.2(>1.4),提示HSV-TK/GCV对放疗具有增敏作用。结论HSV-TK/GCV自杀基因系统具有放射增敏作用,二者联合治疗可作为宫颈癌综合治疗的有效补充方法。

pAdKDR-tk/GCV自杀基因系统联合γ射线放疗鼻咽癌的体内实验

目的:探讨pAdKDR-tk/GCV自杀基因系统联合γ射线放疗人鼻咽癌的杀伤效应。方法:分别以pAdKDR-tk/GCV、60Coγ射线放疗及两者联合治疗裸鼠人鼻咽癌移植瘤模型,比较疗效;利用肿瘤生长曲线及肿瘤抑瘤率评价该自杀基因系统联合放疗的疗效。结果:单纯基因治疗与放疗对鼻咽癌CNE-2细胞裸鼠皮下移植瘤生长的抑瘤率分别为58.43%和70.88%,而基因治疗与放疗联合应用的抑瘤率达到84.39%,与前两者比较,差异有统计学意义(P<0.01);第21天基因治疗与放疗联合治疗组肿瘤平均体积仅为对照组的13.5%,明显低于单纯基因治疗与放疗。结论:pAdKDR-tk/GCV自杀基因系统联合放疗的疗效较单一治疗方案有显著的提高,为进一步开展靶向肿瘤血管内皮自杀基因联合放疗研究奠定了良好的理论和临床基础。

HSV-TK自杀基因联合热疗杀伤肝癌细胞系的实验研究

目的观察单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统联合热疗(hyperthermia)对人肝癌细胞系HepG2体外的杀伤作用。方法采用脂质体转染法将HSV-TK基因转染HepG2细胞,观察GCV联合热疗对HepG2/tk的体外杀伤作用。结果热疗与GCV联用组各温度作用下细胞凋亡率均较对照组和单用GCV组明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。随着温度的升高,热疗联合GCV组诱导细胞凋亡的效果也增强,44℃时细胞增殖抑制率为(78.8±7.5)%,细胞凋亡率达(42.8±3.6)%。结论脂质体可介导HSV-TK基因转染入HepG2细胞并获得稳定表达,热疗可显著提高GCV对HepG2/tk细胞的杀伤效果。

腺病毒介导CD—TK融合基因对肾癌细胞的杀伤作用

肾癌是常见的泌尿系肿瘤，发病率仅次于膀胱肿瘤。自杀基因治疗在晚期肿瘤的综合治疗中发挥了重要作用。单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV—TK）基因／无环鸟昔（GCV）及大肠杆菌胞嘧啶脱胺酶（CD）基因／5-氟胞嘧啶（5-FC）系统治疗机制不同，联合可产生协同效应。本研究旨在探讨联合TK／GCV、CD／5-FC系统在肾癌治疗中的价值。

丹参酮ⅡA增强HSV-tk/GCV旁观者效应及其与Cx43 mRNA表达的关系

目的 研究丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA ,Tan)对HSV tk/GCV旁观者效应的增强作用及其与间隙连接蛋白Cx4 3转录表达的关系。方法 应用polybrene转染、荧光定量RT PCR等技术 ,观察Tan对宫颈癌细胞ME180 (ME)、ME/TK转化细胞旁观者效应及诱导Cx4 3mRNA表达的作用。结果 在HSV tk/GCV系统中 ,Tan显著地提高了ME/TK细胞对GCV的敏感性。在 2 μg/mlGCV作用下 ,以1.3× 10 9mol/LTan与不加Tan的作用相比较 ,在ME与ME/TK不同比例混合细胞的各组中 ,细胞的存活率明显降低 ,差异均有显著性 (P <0 .0 5 )。并观察到Tan对GCV旁观者效应的增强作用 ,在一定范围内为 1.3× 10 -8mol/L和 1.3× 10 -9mol/L。RT PCR结果表明 ,经 1.3× 10 -8mol/L和 1.3× 10 -9mol/LTan处理的ME细胞 ,其Cx4 3mRNA的相对拷贝数比值增高约 8.83倍及 8.4 7倍。结论 在宫颈癌ME180细胞中 ,Tan在 1.3× 10 -8mol/L和 1.3× 10 -9mol/L范围内具有明显增强HSV tk/GCV旁观者效应的作用。Tan在转录水平诱导Cx4 3mRNA表达上调 ,与旁观者效应的增强作用密切相关。

CD—TK双自杀基因系统联合染料木黄酮对鼠前列腺癌的治疗作用

CD-TK双自杀基因包含单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV—TK）和大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因，能将丙氧鸟苷（GCV）及5-氟胞嘧啶（5-Fe）等无毒的前体药物转化成毒性药物，抑制RNA及DNA合成，从而导致肿瘤细胞的凋亡，研究表明二者协同可以显著增强对肿瘤细胞的杀伤作用。