和血柔肝方含药血清通过鞘氨醇激酶-1对肝星状细胞增殖与凋亡的作用

目的:和血柔肝方(HXRGF)含药血清调节鞘氨醇激酶-1(SphK1)对肝星状细胞(HSC)增殖与凋亡的作用。方法:采用Resistin处理HSC-T6细胞,建立纤维化HSC模型,采用LV-rSphK1-OE、LV-rSphk1-shRNA慢病毒方法构建SphK1过表达、低表达稳转细胞株,运用实时定量PCR、WB检测TGF-β、α-SMA、Col I、FN、Smad、SphK1mRNA及蛋白的表达、CCK8实验检测细胞活力、AnnexinV-APC/7-AAD流式细胞学检测细胞凋亡情况。结果:与对照组比较,MF-HSC-T6细胞中可见TGF-β、α-SMA、Col I、FN、SphK1mRNA及蛋白表达水平升高,Smad mRNA水平降低(P<0.01);HSC-T6 SphK1过表达细胞株中SphK1及相关纤维化标志物的表达水平升高(P<0.01);HSC-T6 SphK1低表达细胞株中TGF-β、α-SMA、Col I、FN mRNA等纤维化相关标志物降低,Smad mRNA水平升高(P<0.01)。与模型组比较,中药复方HXRGF含药血清干预后,可见MF-HSC T6 SphK1mRNA及蛋白表达水平降低,并同时伴有α-SMA、Col I、FN表达水平的下降(P<0.01),HSC细胞增殖率下降(110.85%);shRNA-SphK1转染组细胞增殖率下降,凋亡率(12.14%)升高(P<0.01);HSC-T6 SphK1低表达组细胞凋亡率(16.48%)升高(P<0.01)。结论:SphK1可作为肝纤维化潜在治疗靶点。HXRGF干预通过抑制SphK1表达,下调TGF-β、α-SMA等促纤维化因子的表达水平,抑制活化的HSC增殖,诱导HSC凋亡,缓解肝纤维化。

1-磷酸鞘氨醇受体2通过AKT/mTOR通路调节线粒体功能参与Aβ_(25-35)诱导的人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y损伤

阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种与年龄相关的认知功能下降的神经退行性疾病。1-磷酸鞘氨醇受体2(sphingosine-1-phosphate receptor 2,S1PR2)参与多种细胞过程,被证实在神经系统发育中发挥重要作用。本文旨在探究S1PR2对Aβ_(25-35)诱导的AD细胞模型损伤的作用及可能机制。研究通过Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞构建细胞损伤模型,并且构建靶向S1PR2的干扰序列用于干预细胞中S1PR2的表达。Western印迹及RT-PCR检测S1PR2蛋白及基因表达,发现Aβ_(25-35)诱导的细胞模型中S1PR2蛋白及基因表达均显著增加(P<0.01),S1PR2干预后模型组内S1PR2蛋白及基因表达显著降低(P<0.001)。CCK8检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡,结果显示,S1PR2干预后显著增加Aβ_(25-35)诱导的SH-SY5Y细胞的增殖活性,减少细胞凋亡(P<0.01)。Western印迹检测细胞中APP、Tau、p-Tau和PSD95的表达,结果显示,S1PR2干预后显著降低模型组细胞内APP、Tau和p-Tau的表达,增加突触蛋白PSD95的表达,可显著改善Aβ_(25-35)诱导的细胞损伤(P<0.001)。另外,试剂盒检测细胞中ATP的产生,流式细胞术检测ROS含量及线粒体膜电位以分析细胞的线粒体功能,结果显示,Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞显著降低了细胞中ATP的产生,增加了ROS含量,减少了线粒体膜电位(P<0.001)。S1PR2干预后显著增加Aβ_(25-35)诱导的细胞模型中ATP的产生,降低ROS含量,增加线粒体膜电位(P<0.001)。最后,通过Western印迹检测AKT/mTOR通路蛋白质表达,结果显示,Aβ_(25-35)诱导SH-SY5Y细胞促进了p-AKT/AKT及p-mTOR/mTOR的表达,S1PR2干预后显著抑制AKT/mTOR通路的激活(P<0.001)。总而言之,S1PR2可能通过促进AKT/mTOR通路调节线粒体功能参与Aβ_(25-35)诱导的细胞损伤进程。

血清1-磷酸鞘氨醇联合透明质酸检测对结直肠癌的诊断及预后价值

目的:观察分析结直肠癌(CRC)患者血清1-磷酸鞘氨醇(S1P)和透明质酸(HA)的水平变化及相关性,探讨其对结直肠癌诊断和预后评估的临床价值。方法:收集47例结直肠癌患者(结直肠癌组)、30例肠道良性疾病患者(良性疾病组)和38名健康的体检者(健康对照组)的临床资料,并检测所有受试者的血清S1P和HA水平。利用Spearman相关性分析评估两者相关性。采用受试者工作特征(ROC)曲线评估S1P、HA、癌胚抗原(CEA)和糖类抗原19-9(CA19-9)单独和联合诊断CRC的效能。结果:血清S1P水平在健康对照组、良性疾病组及结直肠癌组中逐次升高(P<0.05)。结直肠癌组血清HA水平高于健康对照组(P<0.05),然而良性疾病组的血清HA水平与结直肠癌组和健康对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。根据Spearman相关性分析结果,结直肠癌组血清S1P水平和HA水平之间存在正相关关系(r=0.406,P<0.05)。ROC曲线结果显示,S1P、HA、CEA、CA19-9单独和联合诊断CRC的曲线下面积分别为0.871、0.642、0.694、0.593及0.916。术后CRC患者血清HA水平显著降低(P<0.001),但术后血清S1P水平与术前差异无统计学意义(P>0.05)。结论:血清S1P与HA结合检测在结直肠癌的辅助诊断及预后评估中具有一定的临床价值。

鞘氨醇激酶/1-磷酸鞘氨醇信号通路在糖尿病及其并发症中作用的研究进展

全球糖尿病及其并发症发病率不断增加, 对公共卫生构成重大威胁, 开发对糖尿病及其并发症有效的治疗方法十分必要。鞘氨醇激酶(SphK)/1-磷酸鞘氨醇(S1P)信号轴是鞘脂代谢途径中重要的信号通路。越来越多的证据表明, SphK/S1P信号通路在糖尿病和相关并发症中起着关键作用。该文就SphK/S1P信号通路在糖尿病及其并发症中作用的研究进展作一综述, 以期为其治疗靶点提供思路。

鞘氨醇-1-磷酸受体4在口腔鳞状细胞癌中的表达及生物学功能

目的 :探讨鞘氨醇-1-磷酸受体4(sphingosine-1-phosphate receptor 4,S1PR4)在口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)中的表达及生物学功能。方法 :通过实时荧光定量PCR (RT-qPCR)、免疫印迹实验(Western blot)和免疫组织化学染色,分析OSCC组织样本及细胞系(WSU-HN4、WSU-HN6、CAL27、WSU-HN30)中S1PR4的表达。通过S1PR4拮抗剂(CYM50358)抑制S1PR4活性,利用CCK-8以及克隆形成实验检测CYM50358对OSCC细胞增殖的影响。通过流式细胞术分析CYM500358对OSCC细胞凋亡的影响。采用SPSS 23.0软件包对数据进行统计学分析。结果:OSCC中的S1PR4转录及表达显著上调,CYM50358处理组OSCC细胞增殖活性显著低于空白对照组(P<0.05),CYM50358处理组OSCC细胞克隆形成能力显著低于空白对照组(P<0.05),CYM50358处理组OSCC细胞凋亡比例显著高于空白对照组(P<0.05)。结论:S1PR4在OSCC中表达上调,S1PR4拮抗剂可抑制OSCC细胞生长并促进细胞凋亡,或为OSCC的治疗提供新的潜在靶点。

1-磷酸鞘氨醇受体3对脂多糖处理大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响

目的探讨1-磷酸鞘氨醇受体3(S1PR3)对脂多糖(LPS)处理大鼠肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法将培养好的大鼠肾小管细胞(NRK-52E)分为对照组、LPS组、S1PR3激动剂+LPS组。对照组不做处理;LPS组予LPS(20μg/ml)刺激12h后做离心收集待检;S1PR3激动剂+LPS组先用S1PR3激动剂KRX-725预处理2 h后再予LPS(20μg/ml)刺激12 h后做离心收集待检。流式细胞术检测各组细胞凋亡率、钙离子表达及caspase-3表达的差异,ELISA试剂盒检测Calpain 1、Calpain 2的表达差异,Western Blot检测各组细胞中S1PR3的表达差异。结果LPS处理后脓毒症NRK-52E细胞模型成功建立,相比于对照组,LPS组和S1PR3激动剂+LPS组的细胞凋亡率、S1PR3表达、钙离子浓度、Calpain 1与Calpain2的表达、caspase-3表达均显著增加(均P<0.05);与LPS组相比,S1PR3激动剂+LPS组的细胞凋亡率、钙离子浓度、Calpain 1与Calpain2的表达、caspase-3表达均显著增加(均P<0.05),S1PR3表达显著增加(P<0.05)。结论S1PR3的激活能够增加肾小管上皮细胞内的钙离子浓度,从而激活caspase-3细胞凋亡信号通路,导致脓毒症肾小管上皮细胞凋亡增加。

1-磷酸鞘氨醇在免疫性炎症疾病中的研究进展

1-磷酸-鞘氨醇(Sphingosine-1-Phosphate,S1P)是在人体内广泛存在的生物活性脂质分子,其作用涉及合成、降解、转运,S1P/1-磷酸鞘氨醇受体(Sphingosine 1-Phosphate Receptors,S1PRs)介导信号通路等多个方面。经过数十年的研发,目前已经用于治疗数种炎症免疫性疾病。本文综述了S1P的基本代谢、作用机制,其在临床自身免疫炎症性疾病与在皮肤病中的应用,以及对其未来应用前景的展望。

不同来源的人血清白蛋白对1-磷酸鞘氨醇的结合运载作用研究

目的研究不同来源的人血清白蛋白(human serum albumin,HSA)对1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)的结合运载作用。方法以人血浆来源HSA(plasma derived HSA,pHSA)和基因重组HSA(recombinant HSA,rHSA)样本为研究对象,首先利用LC-MS/MS技术,比较分析上述样本中S1P含量的差异;其次,在生理浓度条件下,向HSA样本中直接添加S1P进行负载处理,比较不同来源的HSA对S1P结合作用;在无血清培养条件下,将不同来源HSA样本与HUVEC细胞进行共培养,分析不同处理组的细胞培养上清中S1P含量的变化,比较不同来源的HSA对细胞中S1P的运载作用。利用表面等离子体共振SPR技术分析不同来源HSA与S1P分子的相互作用情况并计算其亲和力大小。利用AutoDock Vina软件和Molprophet平台,对HSA和S1P进行分子对接分析,并预测HSA中S1P的关键结合口袋域。结果S1P含量检测结果显示,所有pHSA样本中均含有一定水平的S1P(3.31±0.03~30.35±0.07)μg/L,且不同厂家生产的pHSA样本中的S1P含量差异显著(P<0.001);然而所有rHSA样本中均未检测出S1P。负载处理结果显示,不同来源HSA对S1P的结合作用存在显著差异(P<0.001),且rHSA对S1P平均负载量约为pHSA的2倍(ΔC_(rHSA)=801.75±142.45μg/L vsΔC_(pHSA)=461.94±85.73μg/L;P<0.001,t=5.006)。共培养处理结果显示,所有HSA样本处理组与HUVEC细胞共培养处理6h后上清中的S1P浓度均明显升高,而空白对照组上清中S1P浓度无变化;处理6 h、12 h和24 h后各处理组间上清中S1P浓度均存在显著差异(P<0.001)。SPR分析结果显示,与rHSA相比,pHSA与S1P之间的亲和力更高(KD_(pHSA-S1P):2.38E-06,KD_(rHSA-S1P):3.72E-06)。分子对接分析和结合口袋预测发现,HSA与S1P的关键结合口袋可能位于HSA分子的IB亚结构域。结论不同来源的HSA对S1P均具有一定的结合运载作用,但这种作用差异具有统计学意义,与HSA分子的IB亚结构域存在关联。

血清1-磷酸鞘氨醇水平对老年急性脑梗死患者颈动脉粥样硬化斑块形成有一定预测价值

目的:探讨血清1-磷酸鞘氨醇(S1P)水平对老年急性脑梗死(ACI)患者颈动脉粥样硬化(CAS)斑块形成的预测价值。方法:采用横断面法选取入院24 h内接受颈部血管超声检查的老年ACI患者223例,根据有无CAS斑块分为内膜增厚组(72例)和斑块组(151例),另选取同期健康体检者70例作为对照组。检测3组受试者血清S1P水平,采用单因素和多因素Logistic回归分析S1P与老年ACI患者CAS斑块形成的相关性,采用受试者工作特征(ROC)曲线分析S1P对颈动脉不稳定斑块的预测价值。结果:单因素分析显示,患者年龄、胆固醇(TC),甘油三酯(TG)、血清S1P水平与CAS斑块的形成有关(P均<0.05)。斑块组S1P水平显著高于内膜增厚组[(712.63±132.34)ng/mL vs.(656.86±130.58)ng/mL,P<0.05]。多因素Logistic回归显示,S1P是影响CAS斑块形成的独立危险因素(OR>1,P<0.05)。ROC曲线显示,当S1P截断值为685 ng/mL时,曲线下面积为0.97(95%CI:0.970~0.980,P=0.001),敏感度为95.8%,特异性为89.4%。结论:血清S1P水平是老年ACI患者CAS斑块形成的独立危险因素。

子宫内膜癌鞘氨醇激酶-1与1-磷酸鞘氨醇的表达和意义

目的探讨鞘氨醇激酶-1(sphingosine kinase 1,SphK1)与1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)在子宫内膜癌的表达和意义。方法收集正常子宫内膜和子宫内膜癌患者血浆,行子宫全切手术的子宫内膜癌和子宫肌瘤旁组织,ELISA法检测血浆或组织匀浆液S1P的表达,Western blot法检测组织SphK1的表达,组织SphK1激酶活性定量检测试剂盒测定SphK1酶活性。结果和正常对照组相比,子宫内膜癌患者血浆S1P的水平和组织S1P的表达明显增加(P<0.01),子宫内膜癌SphK1酶活性约是正常子宫组织的2.6倍。结论被激活的SphK1/S1P信号通路可能参与子宫内膜癌的发生发展。

脂质活性信号分子鞘氨醇-1-磷酸及其生物学特性

鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)是目前颇受关注的脂质信号分子。体内S1P主要由红细胞内鞘氨醇激酶催化鞘氨醇合成,后经由ATP结合盒式转运子释放入血浆。血浆S1P超过半数存在于高密度脂蛋白和血清白蛋白上。S1P可通过直接胞内作用和激活其特异性G蛋白偶联受体产生多种重要生物学效应。S1P1-5型受体在体内各类型组织和细胞表达水平不同,参与包括细胞增殖、存活、迁移等多种生物学过程。

鞘氨醇激酶1/1磷酸鞘氨醇信号通路在糖尿病肾脏病中的研究进展

糖尿病肾脏病(DKD)为糖尿病最常见且危害严重的微血管并发症之一,其发病率随着糖尿病患者的增加而逐年升高,为全世界社会经济和医疗卫生事业的发展带来了严峻的挑战。DKD发病机制复杂,至今缺乏有效的干预措施。鞘氨醇激酶1/1磷酸鞘氨醇(Sphk/S1P)信号通路通过参与糖尿病条件下肾小球系膜细胞的增殖、细胞外基质的合成以及肾小球局部炎症反应等机制促进肾纤维化,该通路可能成为DKD等肾小球疾病新的干预靶点。

真武汤调节鞘氨醇激酶1-磷酸鞘氨醇信号通路抗阿霉素肾病大鼠肾损伤的作用研究

目的:研究真武汤对阿霉素肾病(Adriamycin Nephropathy,AN)模型大鼠鞘氨醇激酶1(Sphingosine Kinase 1,SphK1)-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)信号分子的影响,探讨真武汤治疗阿霉素肾病大鼠蛋白尿的机制。方法:常规检测各试验组动物血脂、血浆白蛋白、24小时尿蛋白含量;实时聚合酶链反应(Real-time Polymerase Chain Reaction,RTPCR)检测肾组织中SphK1基因表达;免疫印迹法(Western Blot)检测肾组织中SphK1蛋白表达;液相色谱-串联质谱法(Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS)检测SphK1、S1P活性。结果:模型组大鼠血脂水平、24小时尿蛋白含量显著升高,血浆白蛋白水平显著降低(P<0.05),肾脏SphK1酶活性、蛋白表达及S1P含量显著升高(P<0.05);与模型组相比,各给药组血脂水平、24小时尿蛋白含量明显降低,血浆白蛋白水平明显升高(P<0.05),肾脏SphK1酶活性、基因和蛋白表达及S1P含量明显下降(P<0.05),各治疗组之间差异无统计学意义。结论:真武汤可减少AN模型大鼠肾组织的SphK1酶活性、蛋白表达及S1P含量,改善其蛋白尿、血脂及血浆白蛋白水平。其作用可能与抑制SphK1、S1P信号分子的表达有关。

1-磷酸鞘氨醇受体途径诱导的心肌肥大及蛋白激酶C的调节作用

目的研究1-磷酸鞘氨醇受体途径在1-磷酸鞘氨醇(S1P)诱导乳鼠心肌细胞肥大反应中的作用。方法原代培养乳鼠心肌细胞,测定心肌细胞体积和[3H]-亮氨酸掺入量作为心肌细胞肥大的指标。实验分对照组(不加任何干预因素)、S1P组(S1P直接作用于心肌细胞)、VPC23019组(S1P1和S1P3受体抑制剂进行干预30 min后,加入S1P刺激心肌细胞)、JTE组(S1P2受体抑制剂进行干预30 min后,加入S1P刺激心肌细胞)及Staurospo-rine组(蛋白激酶C抑制剂进行干预30 min后,加入S1P刺激心肌细胞),[3H]-亮氨酸掺入法测定心肌细胞蛋白合成速率;用qPCR和Western blot法检测心肌细胞β-肌球蛋白重链的mRNA和蛋白表达水平。结果 10、100和1000 nmol/L的S1P均能增加乳鼠心肌细胞的细胞体积和[3H]-亮氨酸掺入量,尤以1000 nmol/L S1P最为明显,因而选择1000 nmol/L S1P作用心肌细胞48 h为成功的心肌细胞肥大模型。1000 nmol/L S1P处理心肌细胞48 h,可使[3H]-亮氨酸掺入量明显增加,该作用可被S1P2受体抑制剂或蛋白激酶C抑制剂明显抑制。与对照组相比,S1P组心肌细胞β-肌球蛋白重链的mRNA和蛋白表达水平显著增加。与1000 nmol/L S1P组相比,S1P2受体抑制剂组和特异性蛋白激酶C抑制剂组β-肌球蛋白重链的mRNA和蛋白表达水平显著下降。结论 S1P介导的心肌肥大主要依赖S1P2途径介导。S1P2介导心肌肥大反应的机制可能部分通过激活蛋白激酶C途径而实现。

BCR/ABL融合蛋白对鞘氨醇激酶和1-磷酸鞘氨醇分泌的影响

目的研究高表达BCR/ABL融合蛋白对人鞘氨醇激酶(SPK)表达、活性及1-磷酸鞘氨醇(S1P)分泌的影响。方法使用pLXSN和pLXSN-bcr/abl的重组逆转录病毒感染HL-60和ECV304细胞并筛选出pLXSN和pLXSN-bcr/abl的细胞。利用RT-PCR鉴定病毒转染。WesternBlot检测SPK表达,γ-32P-ATP掺入法检测细胞SPK活性和培养上清的S1P含量。应用同样方法检测不同剂量Gleevec对K562细胞培养上清中S1P的影响。结果RT-PCR结果显示bcr/abl基因转染成功。高表达BCR/ABL融合蛋白的HL-60和ECV304均比转染空载体后的细胞SPK表达、活性和S1P分泌均显著提高。随着Gleevec浓度的增加,K562细胞培养上清中S1P的含量逐渐减少。结论BCR/ABL融合蛋白可提高细胞SPK表达、活性和S1P分泌。

鞘氨醇激酶/1-磷酸鞘氨醇信号通路在中枢神经系统疾病中的研究进展

我国当前约有900万以上的癫痫患者,每年新发癫痫患者65~70万,其中约30%为难治性癫痫。癫痫的发病机制复杂,其病理机制至今尚未完全了解,鞘氨醇激酶(Sphingosine kinase,SphK)/1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine-1-phosphate,S1P)通路在癫痫中可能发挥的作用及其机制目前尚不十分清楚。为进一步探索难治性癫痫在分子水平的发病机制,现就SphK/S1P信号通路通过调控炎症反应及细胞凋亡参与癫痫发病机制和可能存在的理想治疗靶点作一综述。

1-磷酸鞘氨醇受体信号在造血干/祖细胞迁移中的作用

目的探讨1-磷酸鞘氨醇受体(S1PRs)在CD34+造血干/祖细胞迁移中的作用。方法用密度梯度离心法分离脐血CD34+细胞,悬浮于transwell培养板的上层,在不同组细胞中分别给予FTY720预处理、含或不含百日咳毒素(PTX)或CXCR4单抗,下层添加SDF-1,流式细胞仪检测迁移细胞数,计算迁移率。同时用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测迁移前后CD34+细胞的S1PRs的表达情况。另用FTY720处理脐血CD34+细胞,在不同时间点(1、8、16h)用流式细胞仪检测CD49d(VLA-4)、CD11a(LFA-1)、CD62L(L-selectin)的表达。结果FTY720不影响CD34+细胞的自发迁移,但明显促进SDF-1诱导的CD34+细胞迁移(15.262.14vs28.642.37),这种作用可以被PTX和CXCR4单抗完全阻断。新鲜分离的脐血CD34+细胞表达S1P1-5,但在FTY720和SDF-1作用下发生迁移的CD34+细胞只表达S1P1、S1P3,S1P4。CD34+细胞在FTY720作用下各个时间点测得的黏附分子表达水平无差别。结论S1PRs可能与CD34+细胞快速迁移有关,激活S1PRs能够增加SDF-1对CD34+细胞的趋化作用,这种作用是通过CXCR4介导的,信号传递偶联PTX敏感的Gi蛋白受体家族。表达特定S1PRs的CD34+细胞才容易发生快速迁移。FTY720不改变CD34+细胞黏附分子的表达。

载脂蛋白AI介导内皮细胞鞘氨醇-1-磷酸释放及其信号机制

背景与目的鞘氨醇．1．磷酸（SIP）是由鞘氨醇激酶1／2（SphKl／2）磷酸化鞘氨醇而合成。血管内皮细胞、红细胞和血小板等是血液S1P的主要来源。S1P释放到细胞外通常受到细胞内或细胞外的刺激。载脂蛋白AI（ApoAI）与ATP结合盒转运体A1（ABCAl）的结合是HDL生成的起始过程，也是胆固醇逆向转运的限速步骤。ApoAI也能结合清道夫受体B类I型（SR-BI）进行胆固醇和磷脂的双向转运。ApoAI除转运胆固醇外，还可转运其他磷脂成分。作为HDL的主要裁脂蛋白，ApoAI是否能促进血管内皮细胞S1P释放，以及其受体信号机制如何是本实验的研究目的。

鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇信号对老年脐静脉内皮细胞增殖及迁移能力的影响研究

目的:探讨鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SPK1)及1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate,S1P)对老年脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)增殖及迁移能力的影响。方法:通过实验确定pLKO.1-shSPK1-GFP干涉慢病毒及pPIG-U6-Scramble-GFP对照慢病毒的最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI),并用最佳MOI感染HUVECs。48 h后提取细胞的蛋白质及RNA,蛋白免疫印迹法(western blot,WB)及实时荧光定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)检测HUVECs内SPK1的蛋白和基因表达水平。用SPK1干涉慢病毒及对照病毒或S1P处理HUVECs,细胞活性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCKit-8)检测细胞的增殖能力,Transwell检测细胞的迁移能力。结果:用最佳感染复数20 MOI的慢病毒感染HUVECs 48 h后,其SPK1的蛋白和基因表达水平均显著下调50%左右(P<0.01或P<0.05)。CCKit-8增殖实验及Transwell迁移实验表明,干涉SPK1可以显著抑制HUVECs的增殖及迁移能力(P<0.01)。而100 nM及200 nM S1P则可以显著促进HUVECs的增殖及迁移能力(P<0.01)。结论:HUVECs内SPK1表达水平的下降可以显著抑制HUVECs的增殖及迁移能力,而其催化产物S1P则可以促进HUVECs的增殖及迁移能力。

1-磷酸鞘氨醇受体3调控RhoA/Rho激酶途径影响糖尿病ED大鼠勃起功能的初步研究

目的探讨1-磷酸鞘氨醇受体3(S1PR3)在Ⅰ型糖尿病所致勃起功能障碍(ED)大鼠阴茎海绵体组织中的表达,为糖尿病ED的机制研究提供依据。方法18只正常8周龄雄性SD大鼠随机分为正常对照组和糖尿病组,建模8周后,测定2组大鼠阴茎海绵体内压/平均动脉压,采用免疫组化、PCR技术和Western blot方法检测S1PR3在2组大鼠阴茎海绵体组织中的表达水平,使用Western blot检测2组大鼠阴茎海绵体组织中RhoA、ROCK1和ROCK2的表达水平。结果与正常对照组相比,糖尿病组大鼠勃起功能明显降低(P<0.05);糖尿病大鼠阴茎海绵体组织中S1PR3 mRNA及其蛋白、RhoA、ROCK1和ROCK2蛋白的表达水平均明显升高(P<0.05)。结论Ⅰ型糖尿病可诱导大鼠ED,其原因可能与大鼠阴茎海绵体组织中S1PR3表达上调,进而激活RhoA/Rho激酶通路有关。