抑制鞘氨醇激酶-2活性加重血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大

目的本实验旨在明确鞘氨醇激酶(sphingosine kinase,Sph K)2在血管紧张素(angiotensin,Ang)Ⅱ诱导的心肌细胞肥大中的作用。方法分离并体外培养SD乳鼠心肌细胞。给予Ang Ⅱ(10μmol/L)处理24h诱导心肌细胞肥大。Ang Ⅱ刺激时分别给予溶媒或Sph K2特异性抑制剂ABC294640(1μmol/L)共处理。采用蛋白免疫印迹法检测心肌细胞Sph K2蛋白表达。采用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbant assay,ELISA)检测心肌细胞细胞核1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)水平。采用结晶紫染色观察Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大程度。采用实时定量聚合酶链式反应(real time-polymerase chain reaction,RT-PCR)检测心肌细胞肥大标志基因心房钠尿肽(atrial natriuretic peptide,ANP)、脑钠尿肽(brain natriuretic peptide,BNP)和β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain,β-MHC)mRNA表达水平。结果与对照组比较,Ang Ⅱ处理上调心肌细胞Sph K2蛋白表达和S1P浓度(均P<0.05),并增加心肌细胞横截面积与ANP、BNP和β-MHC mRNA表达水平(均P<0.05)。与溶媒组比较,ABC294640处理显著降低了心肌细胞核S1P浓度,并进一步增加了Ang Ⅱ处理后的心肌细胞横截面积和肥大标志基因mRNA表达水平(均P<0.05)。结论抑制Sph K2活性加重Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大。Sph K2有可能成为治疗病理性心肌肥大的新靶点。

鞘氨醇激酶-2对星形胶质细胞功能及实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠疾病进程的影响

目的探讨鞘氨醇激酶-2(sphingosine kinases 2,SphK2)对活化的星形胶质细胞功能的调控及对实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)小鼠疾病进程的影响。方法白细胞介素-17(interleukin 17,IL-17)体外诱导C57BL/6野生型(wild type,WT)小鼠及sphk2基因敲除(sphk2-/-)小鼠原代星形胶质细胞活化,real-time PCR测定炎性因子及趋化因子的mRNA转录水平变化,Western blot和免疫荧光检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达及信号转导与转录激活因子3的磷酸化(p-STAT3)水平。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(MOG35-55)多肽体内诱导小鼠EAE模型,Western blot检测脊髓组织中GFAP和p-STAT3的蛋白质表达水平;real-time PCR检测脊髓组织中炎性因子的mRNA转录水平;苏木素-伊红(HE)和劳克坚牢蓝染色(Luxol fast blue,LFB)观察脊髓组织内炎症细胞浸润及髓鞘脱失变化。结果与WT组相比较,sphk2-/-组IL-17体外刺激小鼠原代星形胶质细胞后,p-STAT3水平显著下降;单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)及IL-6等趋化因子及炎性因子的mRNA转录水平明显降低。sphk2-/-EAE小鼠与WT EAE小鼠相比较,上述指标体内变化与体外结果相似,且sphk2-/-EAE小鼠脊髓组织炎性细胞浸润与髓鞘脱失显著减轻,但体内外GFAP的表达差异无统计学意义。结论SphK2可能通过STAT3分子信号调控反应性星形胶质细胞的功能,从而调节炎性因子及趋化因子的产生,参与EAE的病变进程。

七氟烷后处理对小鼠脑缺血/再灌注损伤的作用及影响机制研究

目的探讨七氟烷后处理对小鼠脑缺血/再灌注损伤的作用和影响机制。方法选取首都医科大学动物中心健康雄性BALB/c小鼠,随机数字表法分为5组,每组15只,假手术组(Sham组)、缺血/再灌注组(ischemia/reperfusion,I/R组)、I/R+七氟烷组(I/R+Sev组)、I/R+鞘氨醇激酶-2(sphingosine kinase 2,Sphk2)选择性抑制剂ABC294640组(I/R+ABC组)和I/R+七氟烷+Sphk2选择性抑制剂ABC294640组(I/R+Sev+ABC组)。采用大脑中动脉阻塞法(middle cerebral artery occlusion,MCAO)造成脑缺血损伤,缺血60 min后恢复脑灌注24 h,建立I/R模型。Sev(3%,2 L/min)均于再灌注开始即刻给予,持续吸入1 h;ABC294640均于脑缺血模型制备前从侧脑室注入,剂量为8μl(15 nmol)。缺血再灌注24 h,进行神经行为学评分。随后处死小鼠,各组取5只小鼠分别测脑含水量、缺血半影区细胞凋亡数,并采用Western blot方法检测缺血半影区Sphk2、活化caspase-3和环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX2)表达水平。结果与Sham组比较,I/R组神经功能缺陷评分[(0.0±0.0)分比(3.9±0.5)分]、脑含水量[(68.5±7.3)%比(86.2±9.1)%]、细胞凋亡数[(4±1)个/HP比(50±5)个/HP]、活化caspase-3[(36.1±4.2)%比(81.2±9.2)%]和COX2[(39.1±5.2)%比(95.3±10.1)%]均升高(P<0.05),Sphk2[(25.1±3.1)%比(19.2±3.1)%]表达降低(P<0.05);与I/R组比较,I/R+Sev组神经行为学评分[(3.9±0.5)比(2.4±0.3)]、脑含水量[(86.2±9.1)%比(75.2±8.1)%]、细胞凋亡数[(50±5)个/HP比(19±3)个/HP]、活化caspase-3[(81.2±9.2)%比(50.3±6.1)%]和COX2[(95.3±10.1)%比(52.2±6.4)%]表达均降低(P<0.05),Sphk2[(19.2±3.1)%比(49.3±5.2)%]表达升高(P<0.05);与I/R+Sev组比较,I/R+Sev+ABC组神经行为学评分[(2.4±0.3)比(3.3±0.4)]、脑含水量[(75.2±8.1)%比(82.3±9.1)%]和细胞凋亡数[(19±3)个/HP比(30±4)个/HP]、活化caspase-3[(50.3±6.1)%比(63.2±7.3)%]和COX2[(52.2±6.4)%比(78.4±8.3)%]表达均增高(P<0.05),Sphk2[(49.3±5.2)%比(30.2±4.2)%]表达降低(P<0.05)。结论七氟烷后处理可抑制细胞凋亡而减轻脑损伤,机制可能与Sphk2激活有关。

基于SphK1/S1PR2通路探讨肾必宁颗粒对IgA肾病大鼠肾组织的保护作用

目的:探讨肾必宁颗粒通过鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SphK1)/1-磷酸鞘氨醇受体2(sphingosine 1 phosphate receptor 2,S1PR2)通路改善IgA肾病(IgA nephropathy,IgAN)大鼠肾损伤的作用及机制。方法:将54只健康雄性SD大鼠按照完全随机分组法分为空白组(n=10)、模型组(n=10)、泼尼松组(n=10)、肾必宁低剂量组(n=12)和肾必宁高剂量组(n=12)。除空白组外,其余4组建立IgAN模型,第9周起治疗组灌胃给药,7周后生化检测血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、谷丙转氨酶(ALT)、血清白蛋白(ALB)、尿红细胞计数及24 h尿蛋白定量(24 h-UTP);苏木素-伊红(HE)染色观察各组大鼠肾组织病理学变化;免疫荧光观察IgA沉积;蛋白免疫印迹(Western blot)法检测SphK1、S1PR2蛋白表达;实时荧光定量PCR法(RTPCR)检测SphK1、S1PR2 mRNA表达。结果:与空白组比较,模型组大鼠尿红细胞计数、24 h-UTP、SCr、BUN水平均显著升高(P<0.01或P<0.05),ALB水平显著降低(P<0.01),ALT水平有所升高,但差异无统计学意义(P>0.05),有明显的肾脏病理损伤,免疫荧光可见大量IgA荧光沉积,肾组织SphK1、S1PR2蛋白及mRNA表达水平显著升高(P<0.01);与模型组比较,泼尼松组、肾低组、肾高组大鼠尿红细胞数、24 h-UTP、BUN水平均明显降低(P<0.01),ALB水平显著升高(P<0.01),各组ALT水平有所下降,但差异无统计学意义(P>0.05),肾低组SCr水平显著降低(P<0.05),肾脏病理有不同程度改善,IgA荧光沉积可见不同程度减少,肾组织SphK1、S1PR2蛋白及mRNA表达水平明显下降(P<0.01)。结论:肾必宁颗粒可能通过抑制SphK1/S1PR2通路来降低IgAN大鼠尿蛋白,减轻血尿并改善肾功能,从而起到保护肾脏、防治肾损害的作用。