酸性鞘磷脂酶样磷酸二酯酶3b在足细胞损伤相关肾病中的研究进展

足细胞在维持肾小球滤过屏障的结构和功能方面发挥重要作用,足细胞损伤可导致临床蛋白尿的发生、肾小球硬化及肾功能损害。酸性鞘磷脂酶样磷酸二酯酶3b(SMPDL3b)是足细胞膜上与鞘磷脂代谢相关的糖基磷脂酰肌醇锚定酶,是足细胞功能的重要调节因子,可通过与可溶性尿激酶纤溶酶原激活物受体相互作用,影响整合素活性,导致足细胞表型转变;还与糖尿病肾病胰岛素受体信号通路密切相关,在多种蛋白尿相关性肾脏疾病发病机制中起重要作用。通过稳定体内SMPDL3b水平调控脂类代谢可能成为足细胞相关肾病定向治疗的新靶点。

人免疫缺陷病毒TAT蛋白转导肽与人载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白质3F/3G串联锌结合域的融合表达

目的:分析载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白质3F和3G(APOBEC3F/3G)的蛋白基序,获得具有细胞转导潜力的抗病毒基序融合蛋白。方法:用MotifScan软件对APOBEC3F/3G进行生物信息学分析,找出APOBEC3F/3G中的锌结合域(ZBRs)。通过PCR及多步酶切克隆得到APOBEC3F/3G的3个串联ZBRs基因片段,并将其与人免疫缺陷病毒(HIV)的TAT蛋白转导域基因克隆至原核表达载体(pET32a),转化大肠杆菌BL21(DE3)并诱导表达。结果:酶切和测序鉴定,得到含有HIV-TAT和3个ZBRs基因的重组质粒;十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析,融合蛋白在BL21(DE3)中获得表达,占菌体总蛋白的20%。结论:获得含HIV-TAT和3个ZBRs的融合表达重组蛋白,为进一步研究APOBEC3F/3G抗病毒机制,也为其在抗病毒治疗中的应用打下基础。

宫颈癌组织APOBEC3A蛋白的表达与高危型HPV感染的相关性研究

目的:探讨宫颈癌组织中载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3A(APOBEC3A)表达与高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染的关系。方法:采用免疫组化法检测26例宫颈癌、27例宫颈上皮内瘤变(CIN)I～III和22例正常宫颈组织APOBEC3A蛋白的表达,同时使用凯普分型检测试剂盒对3组样品分别进行高危HPV16/HPV18分型检测。以脂质体法转染APOBEC3A质粒进入HeLa细胞,RT-qPCR与Western blotting验证APOBEC3A对高危型HPV18 E6 mRNA以及蛋白表达的影响。结果:宫颈癌组织、CIN组织以及正常宫颈组织中APOBEC3A蛋白表达的阳性率分别为46.2%、92.6%和86.4%,宫颈癌组织中APOBEC3A蛋白表达较正常宫颈组织明显下降(P<0.01)。宫颈癌组织、CIN及正常宫颈组织中HPV16感染阳性率分别为92.3%、77.8%和54.5%;HPV18感染阳性率分别为80.8%、51.8%和68.2%;APOBEC3A蛋白表达与HPV18感染阳性率呈负相关(P<0.05)。增加HeLa细胞中APOBEC3A的表达明显降低了HPV18 E6 mRNA以及蛋白的表达。结论:在宫颈癌组织中APOBEC3A高表达可以对抗HPV18感染,并抑制HPV18 E6的转录和表达。

激光扫描共聚焦显微镜研究APOBEC3G蛋白的亚细胞定位

采用RT-PCR技术,从HIV的非允许性H9细胞中获得载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)的全长cDNA。APOBEC3G cDNA全长1 155nt,编码384个氨基酸。将APOBEC3G克隆到真核表达载体pEGFP-C3上,转染CD4+HeLa细胞,激光扫描共聚焦显微镜下可观察到表达的GFP-APOBEC3G融合蛋白定位于细胞质。

m6A甲基转移酶METTL3通过β‐arrestin 1/p65调控结肠癌细胞增殖

目的探讨m6A甲基转移酶METTL3通过β-arrestin 1/p65在结肠癌细胞中的作用机制。方法使用结肠癌细胞系HCT116,应用荧光定量PCR、Western blot测定结肠癌细胞中METTL3、β-arrestin 1及增值蛋白PCNA、Cyclin D1及Cyclin E的表达水平;利用细胞转染及细胞克隆实验,观察METTL3、β-arres-tin1和p65在结肠癌细胞增殖中的作用。结果METTL3和β-arrestin 1在结肠癌细胞中表达升高(以actin作为内参基因,与正常对照组比较,P<0.05)。结肠癌细胞转染METTL3-shRNA后,转染组灰度(0.36±0.046)较对照组(1.27±0.14)明显减少(P=0.0004);与对照组克隆数(465±42)比较,转染组细胞增殖(85±37)明显减少(P<0.05);细胞增殖蛋白PCNA、Cyclin D1及Cyclin E的表达也明显减少(分别为P<0.01、0.05、0.01);结肠癌细胞中METTL3、β-arrestin 1和p-p65蛋白表达均增高(均为P<0.05)。随后HCT116细胞沉默MET-TL3的表达,发现细胞中β-arrestin 1、p-p65蛋白的表达明显下降(均为P<0.05)。结论METTL3影响结肠癌细胞的增殖可能通过β-arrestin 1/p65调控参与肿瘤的发生发展。

基于UBA2/PTEN/PI3K/Akt通路探讨蔓荆子黄素对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的 基于泛素样修饰激活酶2(UBA2)/磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)/磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)通路探究蔓荆子黄素对结直肠癌SW480细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法 取对数生长期的SW480细胞,对照组细胞常规培养,蔓荆子黄素组细胞加入10μmol/L蔓荆子黄素培养,UBA2抑制剂组细胞加入0.5μmol/L UBA2抑制剂培养,蔓荆子黄素+UBA2抑制剂组细胞加入10μmol/L蔓荆子黄素和0.5μmol/L UBA2抑制剂共培养。CCK-8实验检测细胞增殖情况,克隆形成实验观察细胞的单克隆形成能力,划痕实验观察细胞的迁移能力,Transwell实验观察细胞的侵袭能力,Western blot法检测细胞中UBA2/PTEN/PI3K/Akt通路相关蛋白表达情况。结果 CCK-8实验和克隆形成实验显示,UBA2抑制剂组和蔓荆子黄素+UBA2抑制剂组培养72 h后的细胞增殖吸光度OD值明显低于蔓荆子黄素组(P均<0.05),细胞克隆形成数量均明显少于蔓荆子黄素组(P均<0.05),UBA2抑制剂组和蔓荆子黄素+UBA2抑制剂组培养不同时间的细胞增殖吸光度OD值和细胞克隆形成数量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。划痕实验和Transwell实验显示,UBA2抑制剂组和蔓荆子黄素+UBA2抑制剂组划痕间距均明显宽于蔓荆子黄素组(P均<0.05),穿膜细胞数量均明显少于蔓荆子黄素组(P均<0.05),UBA2抑制剂组和蔓荆子黄素+UBA2抑制剂组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。蔓荆子黄素组、UBA2抑制剂组和蔓荆子黄素+UBA2抑制剂组细胞中PTEN蛋白相对表达量均明显高于对照组(P均<0.05),UBA2、p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量均明显低于对照组(P均<0.05);UBA2抑制剂组和蔓荆子黄素+UBA2抑制剂组细胞中PTEN蛋白相对表达量均明显高于蔓荆子黄素组(P均<0.05),UBA2、p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量均明显低于蔓荆子黄素组(P均<0.05),UBA2抑制剂组和蔓荆子黄素+UBA2抑制剂组UBA2、PTEN、p-PI3K、p-Akt蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论 蔓荆子黄素可能通过抑制UBA2/PTEN/PI3K/Akt信号通路发挥抗结直肠癌SW480细胞增殖、迁移和侵袭的能力。

m6A甲基转移酶METTL3通过AFF4/NF-κB/MYC信号网络影响膀胱癌的研究进展

膀胱癌(BCa)是泌尿外科最常见的恶性肿瘤之一,发病机制目前尚未明确。甲基转移酶3(METTL3)是N6-甲基腺苷甲基转移酶复合物(m6A MTC)的核心部分,介导mRNA的甲基化修饰,影响mRNA的稳定性和翻译过程。研究表明METTL3可以通过AFF4/NF-κB/MYC信号网络对BCa细胞分裂增殖起到促进作用。该信号网络涉及多种信号分子,METTL3可分别影响AFF4、NF-κB和MYC的表达水平影响其下游通路,促进肿瘤发展。

中药干预NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号通路治疗动脉瘤性蛛网膜下腔出血术后脑血管痉挛研究进展

动脉瘤性蛛网膜下腔出血(aSAH)是一种常见的脑血管疾病,也是目前临床上最难治疗的脑血管疾病之一,其中血管痉挛(CVS)是aSAH后预后不良的关键因素之一。NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号通路参与了aSAH后CVS的病理进程,导致脑血管平滑肌细胞凋亡、炎性因子释放,并激活氧化应激、炎症反应、细胞凋亡等多种病理机制。目前临床多采用尼莫地平、法舒地尔、克拉生坦及他汀类药物治疗,然而目前尚无一种治疗方法可以完全预防或消除术后血管痉挛的发生。中药在治疗aSAH后CVS方面具有多功能、多靶点、多途径的优势,可为aSAH后CVS的治疗提供新的临床思路。本研究主要对NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号通路在aSAH后CVS中的作用进行综述,以期为中药干预NF-κB/NLRP3/Caspase-1信号通路治疗aSAH后CVS提供理论基础。

基于NF-κB/NLRP3/caspase-1通路研究白及多糖对溃疡性结肠炎大鼠肠黏膜炎症损伤的保护作用

目的:探究白及多糖对溃疡性结肠炎(UC)大鼠核因子κB(NF-κB)/核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/半胱天冬酶-1(caspase-1)通路蛋白表达及对肠道屏障损伤的影响。方法:采用三硝基苯磺酸(TNBS)+乙醇法建立UC模型,并将SD大鼠随机分为空白组、模型组、白及多糖低(100 mg/kg)、中(200 mg/kg)、高(400 mg/kg)剂量组、柳氮磺胺吡啶阳性组(0.67 g/kg),除空白组外,其余各组均建立UC模型。白及多糖低、中、高剂量组和阳性组分别灌胃给予相应剂量白及多糖和柳氮磺胺吡啶,空白组和模型组灌胃给予10 ml/kg生理盐水,各组大鼠连续给药2周,1次/d。末次给药12 h后,观察大鼠一般行为并对大鼠进行疾病活动指数(DAI)评分;取大鼠结肠组织,苏木精-伊红染色观察组织病理形态;ELISA检测结肠组织髓过氧化物酶(MPO)、炎症因子IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平及肠道屏障功能受损指标二胺氧化酶(DAO)和肠型脂肪酸结合蛋白(i-FABP)水平;Western blot检测结肠组织通路蛋白NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)、NLRP3、caspase-1、cleaved caspase-1蛋白表达。结果:与空白组比较,模型组大鼠形体消瘦、大便稀溏、结肠组织可见黏膜溃疡、充血、扩张及炎症细胞浸润等病理损伤,DAI评分、结肠组织MPO、IL-1β及TNF-α含量、p-NF-κB p65/NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、cleaved caspase-1蛋白表达均升高(P<0.05),DAO和i-FABP含量均降低(P<0.05)。与模型组比较,白及多糖各剂量组及柳氮磺胺吡啶组大鼠DAI评分、结肠组织病理损伤程度、MPO、IL-1β及TNF-α含量、p-NF-κB p65/NF-κB p65、NLRP3、caspase-1、cleaved caspase-1蛋白表达均降低(P<0.05),DAO和i-FABP含量均升高(P<0.05),且呈剂量依赖性,高剂量白及多糖改善效果与柳氮磺胺吡啶相近(P>0.05)。结论:白及多糖可抑制NF-κB/NLRP3/caspase-1通路激活,降低炎症反应和肠屏障损伤,改善UC症状和肠黏膜损伤。

弥漫大B细胞淋巴瘤内TNFAIP3、PDE4B对肿瘤细胞凋亡、侵袭的影响

目的:研究弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)内肿瘤坏死因子诱导蛋白3基因(TNFAIP3)、磷酸二酯酶4B(PDE4B)对肿瘤细胞凋亡、侵袭的影响。方法:选择2014年8月~2017年7月期间在广州四二一医院诊断为弥漫大B细胞淋巴瘤的68例患者作为研究的DLBCL组,选择同期因淋巴结肿大在广州四二一医院接受淋巴结穿刺活检且诊断为反应性淋巴结增生的34例患者作为对照组。测定淋巴结组织中TNFAIP3、PDE4B以及凋亡基因、侵袭基因的表达量。结果:DLBCL组病灶组织中TNFAIP3、PTEN、PTPL1、Bax的蛋白表达量显著低于对照组(P<0.05),PDE4B、c-myc、AURKA、AURKB、PLK1、Ets-1、β-catenin、MMP7、MMP9、CD44的蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05);DLBCL病灶组织中PTEN、PTPL1、Bax的蛋白表达与TNFAIP3的蛋白表达量呈正相关,与PDE4B的蛋白表达量呈负相关;c-myc、AURKA、AURKB、PLK1、Ets-1、β-catenin、MMP7、MMP9、CD44的蛋白表达量与TNFAIP3的蛋白表达量呈负相关,与PDE4B的蛋白表达量呈正相关。结论:弥漫大B细胞淋巴瘤内TNFAIP3的低表达以及PDE4B的高表达能够拮抗肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞侵袭。

反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的表达

目的：利用反转录病毒载体构建猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白（APOBEC）3F重组质粒,并实现其在猪肾细胞PK15中的表达。方法：用RT-PCR方法扩增五指山猪来源的外周血淋巴细胞APOBEC3F基因,将其定点插入反转录病毒载体pMSCV neo中,同时于插入位点两侧分别添加FLAG和GFP标签,构建重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP,并进行酶切、测序鉴定;将鉴定正确的重组质粒与pVSV-G、pGag-Pol共转染包装细胞HEK293T,分别于转染后48~72 h收集细胞的培养上清以获得假型病毒粒子;用该假型病毒感染猪源细胞PK15,通过PCR、Western印迹检测目的基因的整合及表达。结果：PCR扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,重组质粒pMSCV-FLAG-A3F-GFP经酶切、测序,结果无误;3质粒共转染HEK293T细胞包装出的假型病毒感染PK15细胞后观察到GFP表达;从感染假型病毒的PK15细胞基因组中扩增到1254 bp的猪APOBEC3F基因,Western印迹检测到78.1×103的猪APOBEC3F蛋白的表达。结论：实现了反转录病毒载体介导的猪APOBEC3F在猪源细胞PK15中的整合与表达,为深入研究该分子对猪内源性反转录病毒（PERV）的抑制作用奠定了基础。

血清NSE、CA15-3、S100B、IGF-1在脑胶质瘤中的表达及诊断效能分析

目的探讨神经元特异性烯醇化酶(NSE)、癌抗原15-3(CA15-3)、S100钙结合蛋白B(S100B)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)在脑胶质瘤中的表达水平及诊断效能。方法选择我院2018年3月—2021年3月收治的64例脑胶质瘤作为脑胶质瘤组,另选取同期于我院行颅脑外伤手术者70例作为对照组。检测2组血清NSE、CA15-3、S100B、IGF-1水平,并比较不同病理分级脑胶质瘤患者上述4项指标表达情况,评估其对疾病的诊断效能。结果脑胶质瘤组血清NSE、CA15-3、S100B、IGF-1表达水平均高于对照组(P<0.05)。高级别脑胶质瘤患者血清NSE、CA15-3、S100B、IGF-1表达水平均高于低级别脑胶质瘤患者(P<0.05)。受试者工作特征曲线分析显示,血清NSE、CA15-3、S100B、IGF-1联合检测的曲线下面积、敏感度和特异度均高于单一检测(P<0.05)。脑胶质瘤患者血清NSE、CA15-3、S100B、IGF-1水平与脑胶质瘤病理分级均呈正相关(r=0.398、0.421、0.401、0.435,P<0.05)。结论血清NSE、CA15-3、S100B、IGF-1联合检测对脑胶质瘤的诊断效能较高,并与病理分级呈正相关。

APOBEC3F的真核表达及其抗猪繁殖与呼吸综合征病毒作用的分析

为研究载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样3F(APOBEC3F)对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)增殖的影响,本研究根据GenBank中登录的猪源APOBEC3F基因序列(EU871586)设计引物,经PCR从苏太猪外周血单个核淋巴细胞中扩增APOBEC3F基因,经测序后构建系统进化树分析其遗传进化特性。结果显示,猪源APOBEC3F基因编码区(CDS)长1257 bp,编码418个氨基酸,与其他物种该基因的同源性在60%~70%。利用扩增的APOBEC3F基因构建真核表达载体pcDNA3.1(+)5'Flag-APOBEC3F经菌液PCR和测序鉴定正确后,转染Marc-145细胞,采用间接免疫荧光试验(IFA)和western blot鉴定重组APOBEC3F蛋白的表达。IFA结果显示,转染pcDNA3.1(+)5'Flag-APOBEC3F的Marc-145细胞质中出现特异性红色荧光;western blot结果显示,转染pcDNA3.1(+)5'Flag-APOBEC3F的细胞样品在44 ku处有特异性条带,表明猪源APOBEC3F在Marc-145细胞中获得了表达。在Marc-145细胞中转染不同剂量的pcDNA3.1(+)5'Flag-APOBEC3F或不同剂量的针对APOBEC3F的siRNA,过表达或抑制APOBEC3F表达后感染PRRSV,通过RT-qPCR检测PRRSV N基因mRNA的转录水平,采用western blot检测细胞中PRRSV N蛋白的表达水平,采用TCID50测定PRRSV滴度。结果显示,在Marc-145细胞中过表达的APOBEC3F可以显著抑制PRRSV N基因mRNA转录水平(P<0.01)和N蛋白的表达水平,降低PRRSV滴度(P<0.01、P<0.001),表明APOBEC3F具有抑制PRRSV增殖的作用,且抑制效率与重组质粒的转染剂量呈正相关。在Marc-145细胞中抑制APOBEC3F的表达后,PRRSV N基因的mRNA转录水平(P<0.01)、N蛋白的表达水平与PRRSV滴度(P<0.05、P<0.001)均显著升高,表明抑制APOBEC3F的表达具有促进PRRSV增殖的作用,且该促进效率与针对APOBEC3F的siRNA转染剂量呈正相关。本研究首次证明APOBEC3F对PRRSV在Marc-145细胞中的增殖有抑制作用,为研究APOBEC3F功能提供实验依据,也为研究抗PRRSV相关机制的研究提供参考。

干扰素-α诱导HepG2 2.2.15细胞APOBEC3G的表达及其机制

目的探讨干扰素（IFN）-α刺激HepG2 2．2．15细胞后，对载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽样3G（apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like 3G，APOBEC3G）表达的影响，以及初步探讨Janus激酶-信号传导和转录激活子OAK—STAT）信号通道是否参与APOBEC3G基因转录调控。方法对HepG2 2．2．15细胞给予不同剂量（0、1、10^1、10^2、10^3、10^4 U／mL）IFN-α刺激8h时，以及10^3 U／mL IFN-α刺激2、4、6、8、10、12h时，收集细胞或培养上清液。应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot检测HepG22．2．15细胞APOBEC3G、STAT-1 mRNA及蛋白的表达水平。应用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞培养上清液中乙型肝炎表面抗原与e抗原（HBsAg与HBeAg）水平，应用实时荧光定量PCR及RT-PCR分别检测上清液中HBVDNA水平以及细胞中HBVmRNA水平。结果无IFN-α（0 U／mL）刺激时，HepGa2．2．15细胞APOBEC3G表达水平很低。随着IFN-a浓度的升高，APOBEC3GmRNA及蛋白水平逐步升高，IFN-α浓度为10^4 U／mL时，APOBEC3G表达量最高，并且STAT-1分子mRNA及蛋白的表达量亦逐步升高，与APOBEC3G表达量呈现平行相关。随着IFN-a刺激时间的延长，APOBEC3G表达量明显升高，8h时达到最高，其后逐渐下降。10^4 U／mL IFN-α刺激8h时，HepG2 2．2．15细胞培养上清液中HBsAg、HBeAg、HBVDNA及细胞中HBVmR-NA水平均明显低于无IFN-α刺激的HepG22．2．15细胞。结论WN-a能诱导HepG22．2．15细胞表达APO—BEC3G，在一定范围内，APOBEC3G的表达与IFN—d的剂量、作用时间呈正相关；IFN-α诱导APOBEC3G的表达可能是其发挥抗病毒作用的机制之一；IFN-α是否经JAK-STAT信号通道刺激APOBEC3G的表达，二者之间的关系及其机制尚待进一步研究。

天然免疫抗病毒分子APOBEC3s在宫颈癌组织中的表达及意义

目的:探讨载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3s(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide 3 protein,APOBEC3s)各个蛋白在维吾尔族宫颈癌和宫颈炎组织中的表达及意义。方法:选择2015年1月至2017年12月在新疆维吾尔自治区人民医院妇科门诊和病区行宫颈液基薄层细胞学检查和HC-Ⅱ高危型HPV检测联合筛查并同时行阴道镜活检和组织病理学诊断的维吾尔族妇女148例,其中高危型HPV阴性慢性宫颈炎80例,宫颈癌68例,提取宫颈组织中的RNA和蛋白质,并采用Real-Time PCR检测APOBEC3s各个蛋白mRNA转录水平,采用Western blot检测APOBEC3s各个蛋白表达水平。结果:APOBEC3C、APOBEC3F、APOBEC3G mRNA在宫颈癌组和宫颈炎组表达水平进行比较,差异有统计学意义(P=0.006,0.001,0.003);APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3DE、APOBEC3H mRNA在宫颈癌组和宫颈炎组表达水平比较,差异无统计学意义(P=0.612,0.076,0.247,0.984);采用Western blot检测APOBEC3C、APOBEC3F、APOBEC3G蛋白表达水平在宫颈癌组和宫颈炎组进行比较,差异有统计学意义(P=0.001,0.001,0.001);Western blot检测APOBEC3A、APOBEC3B、APOBEC3DE、APOBEC3H蛋白表达水平在宫颈癌组和宫颈炎组进行比较,差异无统计学意义(P=0.612,0.076,0.247,0.984)。结论:APOBEC3C、APOBEC3F和APOBEC3G与维吾尔族宫颈癌发生具有相关性。

病毒感染因子在APOBEC3G抗病毒中的拮抗作用

病毒感染因子(virion infectivity factor,Vif)是人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)的6个辅助蛋白之一,是病毒进行有效复制所必需的。由于Vif功能的复杂性以及对相应复合物体系的不了解,一直以来,对Vif的研究进展缓慢。直到2002年发现载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(apolipoprotein B mRNA-editing enzyme catalytic polypeptide-like3G,APOBEC3G)是存在于细胞内的一种天然抗病毒因子后,Vif的功能才被逐步阐明。APOBEC3G主要通过嘧啶脱氨基活性使HIV-1的负链DNA在逆转录过程中发生致死性超突变,从而起到抗病毒作用。HIV-1基因编码Vif来拮抗APOBEC3G,二者在宿主细胞内达到动态平衡。Vif通过介导APOBEC3G降解、减少在胞内的表达、阻碍其向病毒粒子的包装以及促使其装配成无活性的高分子质量复合体等多种途径起到中和作用。对Vif/APOBEC3G相互作用及其调节机制的进一步研究,将为新型抗HIV-1病毒药物的研制与开发提供理论依据。

载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽样3G在不同慢性乙型肝炎患者中的表达及其细胞内定位

目的观察载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽样3G（APOBEC3G）在不同慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染类型患者的外周血单个核细胞（PBMC）及肝组织中的表达水平及其细胞内定位。方法用Westernblot及激光扫描共聚焦显微镜，以健康人为对照，检测不同慢性HBV感染类型患者（慢性乙型肝炎、慢性乙型重型肝炎、肝炎肝硬化、HBV相关性肝癌）的PBMC及肝组织中APOBEC3G的表达状况及其亚细胞定位。多组比较采用方差分析，两两比较采用q检验。结果Western blot结果显示，健康人PBMC中APOBEC3G表达水平极低，慢性乙型肝炎、慢性乙型重型肝炎、肝炎肝硬化和HBV相关性肝癌患者PBMC中APOBEC3G蛋白相对表达水平倍数分别为4．12±0．21、4．07±0．28、4．16±0．36、4．21±0．39，均高于健康人。但不同慢性HBV感染类型患者之间两两比较，PBMC中APOBEC3G的表达水平差异无统计学意义（g值分别为0．931、0．744、1．675、1．675、2．606、0．931，P值均〉0．05）。慢性乙型肝炎患者与HBV相关性肝癌患者比较，肝组织中APOBEC3G表达水平差异无统计学意义（4．40±0．34与4．34±0．43，q=0．588，P〉0．05）。激光扫描共聚焦显微镜观察结果显示PBMC中或肝组织中APOBEC3G表达定位于胞质中，胞核中无表达。结论慢性HBV感染患者虽有APOBEC3G的表达升高，可能只是HBV慢性感染的伴随表现，APOBEC3G是否参与机体抵御HBV感染的过程尚不清楚。

稳定表达猪APOBEC3F的PK15细胞单克隆株的建立

目的:利用慢病毒载体建立稳定表达猪载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3F(pAPOBEC3F,简称pA3F)的PK15细胞系。方法:以实验室前期构建的pBPLV-flag-pA3F质粒为模板,PCR扩增pA3F基因,克隆到pLenti-Puro-3Flag载体构建成pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒,Western印迹鉴定其在HEK293T细胞中的表达;将pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒与包装载体共转染HEK293T细胞,包装成Lenti-pA3F慢病毒并测定病毒滴度;将Lenti-pA3F慢病毒感染PK15细胞,通过嘌呤霉素压力筛选并结合有限稀释法,筛选稳定表达pA3F的细胞单克隆株,最终Western印迹检测细胞单克隆株中pA3F的表达。结果:菌落PCR和序列测定表明pLenti-Puro-pA3F-3Flag质粒构建正确,Western印迹显示该质粒可在HEK293T细胞中表达pA3F蛋白;包装了Lenti-pA3F慢病毒,滴度为1.32×10~8TU/mL,慢病毒感染PK15细胞后可检测到pA3F蛋白的表达;经Western印迹鉴定,筛选得到的单克隆细胞可稳定表达pA3F蛋白。结论:建立了稳定表达pA3F的PK15细胞单克隆株,为进一步深入研究猪内源性反转录病毒在pA3F作用下的免疫逃逸机制奠定了基础。

病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ对载脂蛋白B mRNA编辑酶催化样蛋白3G和正常T细胞表达分泌的调节活化蛋白表达的影响

目的:明确病毒巨噬细胞炎症蛋白-II(viral macrophage inflammatory protein-II,vMIP-II)对HIV-1抑制因子:载脂蛋白BmRNA编辑酶催化蛋白3G(apolipoproteon B mRNA-editing catalytic polypeptide-3G,APOBEC 3G)和正常T细胞表达分泌的调节活化蛋白(regulated upon activation normal T expressed and secreted,RANTES)表达的影响。方法:构建vMIP-II真核表达载pEGFP-N3-vMIP-II,分别采用电穿孔和脂质体转染的方法将其转染至Jurkat和293T细胞。荧光定量PCR检测vMIP-II基因对Jurkat细胞和293T细胞内的抗艾滋病基因APOBEC3G和RANTES表达水平的影响。结果:测序结果显示成功构建了的vMIP-II真核表达载体,荧光显微镜观察估计转染效率达到50%左右。与空载体组相比较,转染pEGFP-N3-vMIP-II组的Jurkat细胞内的APOBEC3G和RANTES分别上调4.97倍和7.31倍,293T细胞内的APOBEC3G和RANTES分别上调为5.73倍和8.14倍。结论:vMIP-II基因不同程度的上调了Jurkat细胞和293T细胞内的抗艾滋病基因APOBEC3G和RANTES的表达。

载脂蛋白AⅠ/载脂蛋白B、可溶性糖基化终产物受体和几丁质酶-3样蛋白1与H型高血压患者冠状动脉病变程度的关系

目的 探讨H型高血压患者载脂蛋白AⅠ/载脂蛋白B(ApoAⅠ/ApoB)、可溶性糖基化终产物受体(sRAGE)及几丁质酶-3样蛋白-1(YKL-40)与冠状动脉病变程度的关系。方法 选择2021年6至12月在杭州市余杭区第三人民医院和浙江大学医学院附属杭州市第一人民医院治疗的原发性高血压患者255例,其中H型高血压患者155例[同型半胱氨酸(Hcy)≥15μmol/L]为观察组,非H型高血压患者100例(Hcy<15μmol/L)为对照组。于清晨空腹采集静脉血后,比较两组一般情况和血清ApoAⅠ/ApoB、sRAGE、YKL-40,血清Hcy含量及Gensini评分,分析H型高血压患者冠状动脉病变程度的影响因素。结果 观察组患者血清Hcy含量高于对照组。观察组研究对象病变支数以双支病变、三支病变居多,冠状动脉狭窄程度以Ⅲ级病变、Ⅳ级病变居多;对照组患者以无病变、单支病变居多,冠状动脉狭窄程度以Ⅱ级病变居多;观察组患者Gensini评分高于对照组(23.65±3.12比10.41±2.09,t=37.359);血清ApoAⅠ/ApoB(1.74±0.17比2.34±0.21,t=25.059)、sRAGE水平[(37.12±3.08)比(51.23±6.81)ng/L,t=22.492]低于对照组,血清YKL-40水平高于对照组[(33.09±2.31)比(15.81±1.82)μg/L,t=63.199],均P<0.001。观察组双支病变和三支病变的患者血清ApoAⅠ/ApoB(1.16±0.29比2.16±0.35,t=19.431)、sRAGE水平[(28.45±5.31)比(46.23±4.62)ng/L,t=22.145]低于无病变或单支病变的患者,血清YKL-40水平高于无病变或单支病变的患者[(39.49±3.64)比(18.66±2.36)μg/L,t=41.839;均P<0.001]。观察组冠状动脉狭窄程度≥50%的患者血清ApoAⅠ/ApoB(1.23±0.26比2.31±0.46,t=18.138)、sRAGE水平[(26.32±4.55)比(44.39±3.54)ng/L,t=27.470]低于狭窄程度<50%的患者,血清YKL-40水平高于狭窄程度<50%的患者[(40.11±6.59)比(20.89±4.99)μg/L,t=20.369],均P<0.001。多因素logistic回归分析结果表明,ApoAⅠ/ApoB(OR=0.498,95%CI 0.438~0.567)、sRAGE(OR=0.684,95%CI 0.620~0.754)、YKL-40(OR=1.141,95%CI 1.043~1.249)和Hcy(OR=1.210,95%CI 1.035~1.416)为H型高血压患者冠状动脉病变程度的影响因素(均P<0.05)。结论 ApoAⅠ/ApoB、sRAGE、YKL-40和Hcy水平与H型高血压患者冠状动脉病变程度密切相关。