油桐delta 8脱饱和酶基因的全长cDNA克隆及序列分析

桐油是制备生物柴油的优势原料。delta 8脱饱和酶基因与植物膜脂、鞘磷脂的生物合成及细胞信号传递途径有关。通过简并PCR扩增、3’RACE、5’RACE及编码区扩增获得了油桐delta 8脱饱和酶的全长c DNA序列。该基因全长1 787 bp,ORF的长度为1 344 bp,编码447个氨基酸。经过网上比对分析,发现油桐delta 8脱饱和酶与其它植物的此基因具有较高同源性,其中与蓖麻脂肪酸去饱和酶相似度达83%。研究结果为揭示油桐油脂合成途径及分子定向育种奠定基础。

花生鞘脂Δ8去饱和酶基因( AhSLD2 )的克隆与表达分析

本研究从花生中分离得到了1个AhSLD基因,命名为AhSLD2,该基因开放阅读框(ORF)为1347bp,编码448个氨基酸。AhSLD2蛋白与拟南芥AtSLD的相似性为73%,都具有b5保守结构域和3个组氨酸保守域结构,属于SLD蛋白家族。利用荧光定量PCR对AhSLD2基因在花生中的表达特性进行分析,结果显示AhSLD2主要在茎中表达,并且在种子发育初期表达量最高,AhSLD2基因对干旱和ABA胁迫最敏感,在根中的表达量分别上调了21倍和14倍,推测其可能主要参与花生对干旱胁迫的适应性调节。研究为花生抗逆品种改良提供了新的基因资源。

棉花纤维优势表达基因GhSLD1启动子的克隆和功能分析

【目的】棉花纤维是棉花的主要经济产品,是由胚珠外珠被表皮细胞经极性伸长和次生壁加厚而成的单细胞。棉花纤维细胞是最长的植物细胞之一,是研究植物细胞生长发育的理想材料。鉴定纤维细胞特异或优势表达启动子可为纤维发育的基础研究提供控制目标基因表达的调控序列,为改良纤维性状的分子育种提供依据。【方法】克隆纤维细胞优势表达基因GhSLD1的启动子,通过启动子序列分析网站PlantCARE分析克隆序列中包含的重要顺式调控元件。根据部分重要顺式调控元件的分布,对克隆启动子片段进行5′-端删除,共获得4个启动子片段,并构建了相应的植物表达载体。利用构建的植物表达载体进行烟草和棉花的遗传转化,通过转基因烟草和棉花的分子鉴定明确转基因植株。并检测转基因植株不同组织器官、纤维细胞不同发育时期的GUS活性。【结果】克隆获得最长启动子片段为2900 bp,除了包含多个启动子必备转录调控元件外,还包含多个脱落酸响应元件、厌氧诱导元件、茉莉酸甲酯响应元件、油菜素内酯响应元件、种子特异调控元件、胁迫响应元件和MYB转录因子结合位点。通过5′-端删除获得长度分别为2900(GhSLD-P1)、2178(GhSLD1-P2)、1657(GhSLD1-P3)和1232 bp(GhSLD-P4)4个启动子片段,经分子鉴定,获得4个片段的转基因烟草,在转基因烟草中,GhSLD-P1、GhSLD1-P2和GhSLD1-P3不表达,而GhSLD-P4广泛表达,表达强度与CaMV 35S启动子相似。GhSLD1-P3和GhSLD-P4差异序列中包含4个脱落酸响应元件、2个油菜素内酯响应元件和3个MYB结合位点,这些顺式调控元件可能与GhSLD1-P1、GhSLD1-P2和GhSLD1-P3在转基因烟草中不表达有一定关系。经分子鉴定,获得GhSLD1-P2转基因棉花。GhSLD1-P2在转基因棉花纤维中优势表达,在转基因花粉中有较低的表达,在其他组织器官中几乎不表达。在纤维细胞的生长发育过程中,GhSLD1-P2在纤维细胞早期生长阶段(5 DPA)表达较低,在纤维细胞伸长期(10—15 DPA)表达水平相对较高,在纤维细胞次生壁合成期(20—30 DPA)表达水平有所降低。【结论】GhSLD1-P4启动子是一个广泛表达启动子,GhSLD1-P2启动子是一个纤维细胞优势表达启动子,在纤维细胞伸长期表达量相对较高。可应用于棉花纤维发育相关基因的功能研究和改良纤维性状的分子育种。

小眼虫藻Δ~8-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及其在酿酒酵母中的表达

Δ8途径是合成多不饱和脂肪酸的替代途径,Δ8-脂肪酸脱氢酶是该途径的关键酶之一。根据已报道的Δ8-脂肪酸脱氢酶基因设计引物,分别从小眼虫藻基因组DNA和cDNA中扩增得到该基因片段,序列分析表明:结构基因长1266bp,编码421个氨基酸;该基因没有内含子,比已经报道的Δ8-脂肪酸脱氢酶基因长6bp,并且N末端序列也有所不同。利用酿酒酵母的载体pYES2.0构建Δ8-脂肪酸脱氢酶表达载体pYEFD,并转化到营养缺陷型酿酒酵母菌株INVSc1中,在选择培养基中筛选得到酿酒酵母转化菌株YD8。YD8在合适的培养条件下,添加外源底物二十碳二烯酸和二十碳三烯酸并诱导基因表达。脂肪酸甲酯气相色谱分析表明小眼虫藻Δ8-脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中获得了高效表达,将二十碳二烯酸和二十碳三烯酸分别转化成二高-γ-亚麻酸和二十碳四烯酸,其底物转化率分别达到了31.2%和46.3%。

4.10MPa氢氧暴露对大鼠氧化应激影响研究

目的探讨4.10 MPa氢氧暴露对大鼠氧化应激的影响。方法无特定病原体级健康成年雄性SD大鼠30只随机分为对照组、氦氧组和氢氧组。3组大鼠分别在动物加压舱内的常压常氧空气、4.10 MPa氦氧及4.10 MPa氢氧环境中暴露24 h。出舱后处死大鼠,分离脑、肺和肝组织,比色法测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力和还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)和8-羟基脱氧鸟苷(8-OhdG)水平。结果对照组、氦氧组和氢氧组3组大鼠脑组织SOD、GSH-Px活力及GSH水平分别比较,差异均有统计学意义[(153.09±37.62)vs(114.97±23.38)vs(162.31±36.03)mmol/(min·gprot),(1 042.27±248.32)vs(746.77±188.13)vs(1 040.73±192.41)μmol/(min·gprot),(2.45±0.64)vs(1.46±0.36)vs(2.06±0.49)mg/gprot,P<0.05,P<0.05,P<0.01];氦氧组脑组织SOD、GSH-Px活力及GSH水平均低于对照组(P<0.05),氢氧组脑组织SOD、GSH-Px活力和GSH水平均高于氦氧组(P<0.05)。3组大鼠肺组织GSH-Px活力和GSH水平分别比较,差异均有统计学意义[(437.29±46.62)vs(358.34±31.49)vs(446.40±55.52)μmol/(min·gprot),(2.30±0.55)vs(0.98±0.13)vs(1.67±0.30)mg/gprot,P<0.01,P<0.05];氦氧组肺组织GSH-Px活力和GSH水平均低于对照组(P<0.05),氢氧组肺组织GSH-Px活力高于氦氧组(P<0.05)。3组大鼠肝组织SOD和GSH-Px活力分别比较,差异均有统计学意义[(101.31±9.67)vs(93.99±6.13)vs(112.23±11.41)mmol/(min·gprot),(325.28±34.39)vs(276.67±22.29)vs(341.05±31.74)μmol/(min·gprot),P<0.01];氦氧组肝组织GSH-Px活力低于对照组(P<0.05),氢氧组肝组织中SOD和GSH-Px活力均高于氦氧组(P<0.05)。氢氧组脑、肺和肝3种组织SOD、GSH-Px活力及GSH水平分别与对照组相应组织比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。3组组间脑、肺和肝3种组织的MDA及8-OhdG水平分别比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论 4.10 MPa氢氧暴露大鼠的氧化应激指标未显现出明显改变,与氢对高氧毒性的抑制作用有关。从氧化应激的角度看,高压氢氧环境比高压氦氧环境具有更好的生理安全性。