鞭毛素蛋白联合雷帕霉素对4T1乳腺癌细胞及荷瘤小鼠的抑制作用

目的 在乳腺癌4T1细胞构建的荷瘤小鼠模型中,探讨鞭毛素蛋白(flagellin,FliC)与雷帕霉素(rapamycin,RAPA)联用对肿瘤生长和转移的影响,并探讨其对部分免疫细胞的调节作用。方法 用小鼠乳腺癌4T1细胞建立Balb/c肿瘤模型,分别注射鞭毛素蛋白和(或)雷帕霉素,并定期记录肿瘤大小,计算肿瘤抑制率。用MTT法检测二者联用对乳腺癌4T1细胞的抑制作用。用流式细胞术检测荷瘤小鼠肿瘤组织中CD11b+Gr-1+骨髓来源的抑制性细胞(MDSCs)和CD11b+F4/80+肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的百分比。用HE染色检测肝、肺组织中转移情况。结果 体内实验中,RAPA和FliC对肿瘤生长均有抑制作用,但RAPA+FliC组抑制效果最好(F=5.593,P<0.05)。在体外实验中,给药组对4T1细胞增殖的抑制率均高于Control组,但RAPA+FliC组的抑制率最高。肿瘤组织中,与FliC组和Control组相比,RAPA+FliC组和RAPA组组织细胞中CD11b+Gr-1+MDSC和CD11b+F4/80+TAM百分比基本相同且均为最低(P<0.05)。与Control组相比,RAPA组和RAPA+FliC组肝、肺组织肿瘤转移情况较轻。结论 鞭毛素蛋白与雷帕霉素联合作用可抑制4T1细胞的增殖活性,并增强乳腺癌荷瘤小鼠抗肿瘤效应,抑制肿瘤生长和转移。其机制可能与肿瘤微环境中免疫细胞浸润有关,但具体相关性还有待进一步证实。

鞭毛素fliC基因的缺失对肠炎沙门氏菌生物膜形成的影响

为研究肠炎沙门氏菌鞭毛素对其生物膜形成的影响,本研究利用构建的肠炎沙门氏菌鞭毛素编码基因fliC缺失株,检测其缺失性修饰后的生长表型变化及其对生物膜形成的影响。结果显示在表型检测试验中,fliC缺失株在电镜下观察呈无鞭毛形态,在半固体培养基上缺乏运动性,并且不能与肠炎沙门氏菌鞭毛单克隆抗体发生可见的凝集反应。生物膜形成能力定性试验结果表明,肠炎沙门氏菌fliC缺失株生物膜形成大量减少,并且生物膜脆弱,而其回补株能够较好地恢复生物膜的形成;生物膜定量结果进一步证明,鞭毛素fliC基因缺失后肠炎沙门氏菌形成生物膜的能力下降50%左右,以上结果显示鞭毛在肠炎沙门氏菌体外生物膜形成中具有重要作用。

沙门菌鞭毛素C蛋白基因型与血清型关系的研究

目的 探讨沙门菌鞭毛素 C蛋白基因型与血清表型的关系。方法 从几种沙门菌临床分离株提取基因组 ,以此为模板通过聚合酶链反应 (PCR)扩增相应的鞭毛素 C基因片段 ,对扩增的片段进行测序和琼脂糖凝胶电泳分析。结果 从鞭毛血清型为 H - 1- d的细菌基因组中可以扩增出特异性 PCR产物 ,这些细菌包括慕尼黑沙门菌 (Salmonella muenchen) ,伤寒沙门菌 (S.typhi)和鼠伤寒沙门菌 (S.typhimurium ) ,但是从其他血清型的菌株 [丙型副伤寒沙门菌 ,(S.paratyphoid C)和肠炎沙门菌 (S.enteritidis) ]基因组中则不能扩增出相应的片段。结论 本实验提示 ,同菌株鞭毛抗原血清型存在特异性一样 ,沙门菌鞭毛素 C中间可变区核苷酸序列也存在特异性 ,这一结论可能为检测鞭毛血清型为 H- 1- d沙门菌提供一种快速、灵敏。

激活TLR5和NLRC4通路的重组鞭毛素蛋白对不同乳腺癌细胞系增殖的抑制作用

目的:探究激活TLR5和NLRC4通路的重组鞭毛素蛋白对不同乳腺癌细胞系增殖的抑制作用。方法:表达和纯化重组鞭毛素蛋白即全长鞭毛素蛋白Fli C(同时激活TLR5和NLRC4两条通路)、Fli CΔ90-97(不能激活TLR5通路)、Fli C-L3A(不能激活NLRC4通路)和Fli CΔ90-97:L3A(两条通路都不激活)。用不同浓度的重组鞭毛素蛋白刺激MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞,72 h后,利用CCK8法检测其对肿瘤细胞增殖的影响,并计算抑制率。软琼脂形成实验:每孔细胞数为1 000个MCF-7细胞铺于6孔板中,重组鞭毛素蛋白浓度为1μg/ml,培养14 d后,结晶紫染色,显微镜下计数克隆数,计算克隆形成率。结果:四种鞭毛素蛋白在0.1μg/ml的浓度刺激下,对MCF-7细胞的抑制率达到30%,Fli CΔ90-97对MCF-7的抑制作用是剂量依赖的。在1μg/ml时单独激活TLR5的Fli C-L3A鞭毛素蛋白的抑制率高于全长的Fli C和单独激活NLRC4的Fli CΔ90-97。Fli CΔ90-97:L3A也对MCF-7细胞有抑制作用。四种鞭毛素蛋白对MDA-MB-231细胞在加转染试剂之后才表现出抑制效应。结论:鞭毛素蛋白可以抑制乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞的增殖,其机制可能是由于分别激活胞膜和胞内的除TLR5和NLRC4以外的其他通路。

东西方幽门螺杆菌鞭毛素A差异分析

目的对东西方幽门螺杆菌鞭毛素A(flagellin A,FlaA)的差异进行对照研究,并探讨这些差异对FlaA免疫学特性的影响。方法借助软件分析FlaA的结构信息和理化性质;从西京医院门诊病人分离了的6株幽门螺杆菌基因组DNA中扩增FlaA可变区的序列并与Genbank中的10株幽门螺杆菌的相应氨基酸序列进行差异比较。结果软件分析显示幽门螺杆菌FlaA具有典型的鞭毛丝蛋白的结构特征,在中央可变区发现三个亲水峰和两处N乙酰糖基化位点,分別位于第一和第二个亲水峰。对16株幽门螺杆菌的差异分析发现三个特征性的差异,种系分析结果显示按序列同源性大致分为两类,并与差异分析的结果吻合。结论幽门螺杆菌FlaA是一个具有特征性二级结构和高级结构的分了,东西方FlaA中央可变区氨基酸序列无明显特征性的差异,16株幽门螺杆菌按种系分析结果和FlaA中央可主为区氨基酸序列的特征性差异可分为两类.结构和理化性质分析提示这些特征性差异可能对FlaA分子的免疫学特征有潜在的影响。

Hp鞭毛素A中央区氨基酸序列多态性研究

利用聚合酶联(PCR)技术从6例消化性溃疡患者的胃组织中分离6株幽门螺杆菌菌株扩增鞭毛素A中央区基因序列,另外10株幽门螺杆菌的序列来自G enbank,比较相应氨基酸序列寻找变异性氨基酸。结果显示,东西方菌株间无明显差别。幽门螺杆菌鞭毛素A中央区氨基酸序列存在多态性。

细菌鞭毛素对植物免疫防卫反应及其信号机制的激发

细菌鞭毛素(flagellin)是一类可以诱导寄主植物细胞发生防卫反应的病原物相关分子模式(PAMP)因子,其活性位点是被称为flg22的N-末端保守的22个氨基酸多肽,植物体内与其结合的模式识别受体是FLS2。flg22可以诱导植物细胞发生活性氧(ROS)的猝发、细胞培养介质碱化、一氧化氮(NO)的产生,胼胝质沉积以及MAPK级联反应、防卫基因表达等多种防卫反应。本文结合本室有关水稻白叶枯病菌的研究结果,综述近年来国内外在鞭毛素诱导植物防卫反应研究领域的最新研究进展。

燕麦嗜酸菌鞭毛素的提纯及其活性检测

为阐明燕麦嗜酸菌(Aaa)鞭毛素作为一种病原相关分子模式(PAMP)诱导水稻免疫反应(PTI)的作用机理,采用机械震荡、丙酮沉淀以及离子交换层析进行了蛋白提纯,并用DAB染色法对其诱导水稻产生H2O2的能力进行了测定。结果表明,上述提纯方法的组合使用有效地提纯了分子量约为45 kD的鞭毛素,经浸润接种处理后诱导了水稻叶组织H2O2的产生。因此,Aaa鞭毛素提纯蛋白可用于后续的水稻PTI机理分析。

激活TLR5和NLRC4通路的重组鞭毛素蛋白对4T1乳腺癌细胞及荷瘤小鼠的影响

目的:激活TLR5和NLRC4通路的重组鞭毛素蛋白对4T1乳腺癌细胞及荷瘤小鼠的影响。方法:表达和纯化重组鞭毛素蛋白即全长鞭毛素蛋白FliC(同时激活TLR5和NLRC4两条通路)、FliCΔ90-97(不能激活TLR5通路)、FliC-L3A(不能激活NLRC4通路)和FliCΔ90-97:L3A(两条通路都不激活)。ELISA实验检测IL-8和IL-1β验证重组鞭毛素蛋白激活TLR5和NLRC4通路的生物学活性。MTT法检测鞭毛素蛋白对4T1乳腺癌细胞的抑制作用。用4T1乳腺癌细胞建立BALB/c小鼠乳腺癌肿瘤模型,分别腹腔注射鞭毛素蛋白或生理盐水,并定期记录小鼠肿瘤大小、体重变化。结果:重组鞭毛素蛋白能够激活相应的信号通路,具有正常生物学活性。不同重组鞭毛素蛋白对4T1细胞均有抑制作用,且与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05),各重组鞭毛素蛋白对4T1的抑制作用无显著差异。体内实验:FliC处理组的小鼠前3周平均体重显著下降,FliCΔ90-97:L3A组、FliCΔ90-97组和FliC-L3A组体重在整个实验期间有不同程度的增加;FliCΔ90-97对小鼠肿瘤生长没有明显抑制作用,但FliC-L3A、FliCΔ90-97:L3A和FliC都能够显著抑制肿瘤的增殖。结论:重组鞭毛素蛋白体外抑制乳腺癌4T1细胞增殖与TLR5和NLRC4通路的激活无关,体内NLRC4通路的激活减弱了鞭毛素蛋白抑制肿瘤增殖的能力,TLR5通路的激活并不能显著增强鞭毛素蛋白的抗肿瘤免疫应答。

胞内劳森菌鞭毛素蛋白FliC与猪肠上皮细胞互作蛋白的研究

为鉴定胞内劳森菌鞭毛蛋白FliC与猪肠上皮细胞中的互作蛋白,本研究利用PCR方法从回肠炎疫苗提取的DNA中扩增胞内劳森菌鞭毛素基因LI0710,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中构建重组质粒pET32aLI0710,经双酶切及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导并经SDS-PAGE检测。结果显示,获得可溶且与硫氧还蛋白-6×His-S标签(Trx-His-S)融合表达的重组FliC蛋白(Trx-His-S-FliC)。采用镍柱亲和层析法纯化Trx-His-S和Trx-His-S-FliC,并分别与猪肠上皮细胞(IPEC-J2)裂解液孵育后,利用anti-His抗体进行免疫共沉淀试验(Co-IP),并对沉淀物利用液质联用串联质谱(LC/MS/MS)技术分析与FliC互作的宿主蛋白,利用Proteome Discoverer 1.4软件在UniProtKB/Swiss-Prot数据库中对互作的宿主蛋白进行肽指纹图谱分析。Co-IP结果显示,检测到了多个与Trx-His-S-FliC互作的宿主蛋白,且通过LC/MS/MS技术共鉴定到50个与FliC互作的蛋白。这些互作蛋白包括蛋白酶、多个核糖体蛋白和线粒体蛋白,广泛参与了细胞质糖酵解、氨基酸代谢、ATP跨膜转运等功能。为了证明质谱数据的可靠性,选择与FliC互作最强的胰蛋白酶经western blot验证,结果显示,胰蛋白酶与FliC蛋白确实存在互作,表明质谱数据可靠。本研究首次鉴定到多个与胞内劳森菌鞭毛蛋白FliC互作的宿主蛋白,为研究FliC蛋白的功能奠定了基础。

分子佐剂鞭毛素对弓形虫SAG1蛋白抗体应答的影响

将沙门氏菌鞭毛素和弓形虫免疫优势表面抗原1(SAG1)融合表达,研究其在小鼠上激发的体液免疫应答.首先,采用PCR扩增SAG1片段.其次,将SAG1连接到原核表达载体pET-28a中构建表达质粒pET-28a-SAG1;连接到实验室已有的pET-28a鞭毛素质粒中构建表达质粒pET-28a-F-SAG1;质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中并进行表达.将纯化后的蛋白免疫小鼠,每隔2周免疫一次,共免疫3次,第3次免疫后15 d取小鼠血清.最后,采用蛋白印迹检测蛋白的大小;用酶联免疫吸附方法检测血清中多克隆抗体的效价.结果表明,诱导出的SAG1蛋白大小为30 ku,F-SAG1大小为70 ku.酶联免疫吸附方法检测的D450 nm均为阴性对照的两倍,表明该多克隆抗体具有较高效价.可见,鞭毛素可以作为分子佐剂促进弓形虫亚单位疫苗的体液免疫应答.

5种细菌鞭毛素蛋白诱导细胞因子IL-4、IFN-γ mRNA的表达水平

选择5种不同细菌来源的鞭毛素蛋白刺激猪外周血淋巴细胞,利用荧光定量PCR检测相关细胞因子白介素4(IL-4)和γ-干扰素(IFN-γ)mRNA的表达水平,进一步选择4个含量(0.1、1.0、5.0、10.0μg·m L^(-1))的创伤弧菌鞭毛素蛋白,探讨其诱导IFN-γ的表达效果.结果表明,鞭毛素蛋白可以显著提高IFN-γmRNA的表达水平(P<0.05),以创伤弧菌(Vibrio vulnificus MO6-24/O)的效果最佳.4个含量的创伤弧菌鞭毛素蛋白均能显著提高猪外周血淋巴细胞IFN-γmRNA的表达量(P<0.05),其中以5.0μg·m L^(-1)为创伤弧菌鞭毛素蛋白的最适含量.本试验主要目的是筛选一种能够有效提高猪免疫功能的细菌鞭毛素蛋白,为挖掘新型疫苗佐剂提供基础.

鞭毛素蛋白FliCaaa诱导水稻免疫反应的活性测定

为阐明燕麦嗜酸菌(Acidovorax avenae subsp.avenae,Aaa)鞭毛素蛋白Fli Caaa及其结构域对水稻免疫反应的诱导作用,通过分子生物学和生物信息学方法,对Aaa菌株IPN1的鞭毛素进行基因克隆及其序列分析;在大肠杆菌中对该基因全长、N端和C端片段进行了原核表达,纯化了Fli Caaa蛋白及其截短肽段;采用水稻叶片浸润法测定了表达蛋白对水稻免疫反应的诱导活性。结果表明,通过特异性引物的PCR扩增,获得1 479 bp的鞭毛素基因fli Caaa,其编码产物含有492个氨基酸,分子量为49.4 k D,具有flagellin-N和-C两个保守结构域;原核诱导表达获得了Fli Caaa、Fli Caaa-N和Fli Caaa-C可溶性融合蛋白;3种纯化蛋白均能诱导水稻细胞死亡和H2O2产生等免疫反应,但诱导能力略有差异。

鞭毛素蛋白FliCxcv对水稻免疫反应的诱导功能鉴定

为揭示来源于番茄细菌性斑点病菌(Xanthomonas campestris pv.vesicatoria,Xcv)菌株XV18鞭毛素(FliCxcv)作为一种病原相关分子模式(PAMP)诱导水稻免疫反应的功能,本研究对FliCxcv编码基因flicxcv进行了基因克隆、序列分析、原核表达、蛋白纯化和诱导活性测定。结果表明,通过PCR特异性扩增,从Xcv菌株XV18中克隆了1 200bp的fliCxcv基因片段,其序列与GenBank中己测序菌株的完全一致。在大肠杆菌中对该基因全长、N端和C端截短序列进行了原核表达,并获得了纯化的FliCxcv全长及其截短蛋白。将纯化蛋白浸润接种到水稻品种日本晴叶片组织,发现FliCxcv全长及其截短蛋白均能诱导水稻叶片细胞死亡、H2O2产生以及防卫基因(OsPAL和OsPR1b)表达等免疫反应,但诱导活性存在差异。因此,本研究验证了FliCxcv具有激发水稻细胞免疫反应的PAMP功能,为水稻免疫诱导制剂的研发提供了材料。

幽门螺杆菌黏附素HLA-DRB1限制性CD4+T细胞表位的预测与鉴定

目的针对中国汉族高频HLA-DRB1基因型人群,预测与鉴定幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)黏附素蛋白A亚单位(neuraminyllactose-binding hemagglutinin,HpaA)CD4+T细胞表位。方法通过Allele Frequency Net数据库分析中国汉族人群HLA-DRB1高频基因型,利用NetMHCIIpan对HpaA蛋白中能被这些高频基因型递呈的CD4+T细胞表位进行预测;通过PCR-SBT法筛选携带有这些高频基因型的H.pylori感染者,利用重组HpaA抗原刺激感染者外周血单个核细胞体外扩增出HpaA抗原特异性T淋巴细胞后利用合成短肽对所预测表位进行鉴定,通过抗体阻断实验对表位的HLA限制性进行分析,利用DC细胞负载重组HpaA蛋白对表位的自然递呈特征进行分析。结果中国汉族人群中HLA-DRB1高频基因型为DRB1*0901(14.4%)、DRB1*1202(13.3%)和DRB1*1501(10.8%),针对上述3种高频基因型预测出24个HpaA蛋白CD4+T细胞表位。其中,4个表位:HpaA39-53(HLA-DRB1*0901)、HpaA42-56(HLA-DRB1*0901)、HpaA89-103(HLA-DRB1*1202)和HpaA87-101(HLA-DRB1*1501)可有效刺激体外扩增的HpaA特异性T细胞产生高水平IFN-γ,且均能被DC细胞自然递呈。结论鉴定得到的4个HLA-DRB1限制性CD4+T细胞表位有可能成为H.pylori表位疫苗设计的候选抗原。

重组幽门螺杆菌粘附素的纯化工艺

目的纯化大肠杆菌表达的重组幽门螺杆菌粘附素。方法将表达HpaA蛋白的工程菌经高压均质机破菌获得包涵体,经洗涤、变性、复性,Q Sepharose High Performance阴离子交换层析和亲和层析分离纯化。采用SDS-PAGE和HPLC检测纯度,用Western blot检测其抗原性。结果纯化后HpaA蛋白纯度高达95％以上,具有良好的抗原性。结论建立了从包涵体中获得高纯度HpaA纯化工艺,为进一步的研究打下了基础。

激活TLR5和NLRC4通路对小鼠先天免疫细胞的影响

目的:探讨用重组鞭毛素蛋白同时或者分别激活C57BL/6小鼠模型TLR5和NLRC4通路对小鼠先天免疫细胞的影响。方法:首先,表达和纯化重组鞭毛素蛋白即全长鞭毛素蛋白FliC(同时激活TLR5和NLRC4两条通路);FliCΔ90-97(不能激活TLR5通路);FliC-L3A(不能激活NLRC4通路);FliCΔ90-97:L3A(两条通路都不激活)。将小鼠分为5组,分别为:PBS组、FliC组、FliC-L3A组、FliCΔ90-97和FliCΔ90-97:L3A组。分别用PBS和10μg重组鞭毛素蛋白腹腔注射C57BL/6小鼠,每组3只。12 h后收集腹腔灌洗液,流式抗体染色检测腹腔灌洗液中的中性粒细胞和NK细胞的比例。同时,取小鼠脾脏制成脾细胞悬液,流式抗体染色检测DC表面共刺激分子CD80和CD86的表达情况及脾细胞中调节性T细胞(Treg)的比例。结果:激活TLR5(FliC组和FliC-L3A组)和NLRC4通路(FliCΔ90-97组)小鼠的腹腔灌洗液中中性粒细胞和NK细胞的比例都显著高于PBS组和FliCΔ90-97:L3A组(P<0.01)。激活TLR5通路的FliC组和FliC-L3A组的DC表面CD80和CD86表达水平显著高于PBS组、FliCΔ90-97和FliCΔ90-97:L3A组(P<0.01)。FliC-L3A组调节性T细胞的比例高于其他组(P<0.05)。结论:激活TLR5和NLRC4通路可以趋化中性粒细胞、NK细胞,两条通路激活对中性粒、NK细胞有相同的趋化能力。鞭毛素蛋白只有激活TLR5通路才可以上调DCs表面共刺激分子CD80和CD86,促进DCs的成熟。

幽门螺杆菌flaA基因的变异

目的鞭毛是幽门螺杆菌（Ｈｐ）的重要侵袭因子，本研究拟检测Ｈｐ鞭毛素Ａ基因的变异性，进而研究其与Ｈｐ致病性的关系．方法我们对５２例胃粘膜活检标本和１８株Ｈｐ临床分离株进行Ｈｐ特异的１６ＳｒＲＮＡ基因和鞭毛素Ａ基因ＰＣＲ扩增和ＰＣＲＲＦＬＰ及ＰＣＲＲＦＬＰＳＳＣＰ分析．结果对４３例Ｈｐ（＋）的ｆｌａＡ基因ＰＣＲＲＦＬＰ（ＨｉｎｄⅢ）大约可分７个型（变异检出率为１６３％），而ＰＣＲＲＦＬＰＳＳＣＰ可分３７个型（变异检出率为８６０％），两者有非常显著性差异．结论ｆｌａＡ基因变异性极大，ＰＣＲＲＦＬＰＳＳＣＰ优于ＰＣＲＲＦＬＰ，是检测其变异的有效方法．

疫苗

构建了一种基因工程系统,以用来克隆大肠杆菌K88ac和K88ad鞭毛素基因中编码一种肤的DNA序列并使它们表达为重组鞭毛.