胞内劳森菌鞭毛素蛋白FliC与猪肠上皮细胞互作蛋白的研究

为鉴定胞内劳森菌鞭毛蛋白FliC与猪肠上皮细胞中的互作蛋白,本研究利用PCR方法从回肠炎疫苗提取的DNA中扩增胞内劳森菌鞭毛素基因LI0710,并将其克隆至原核表达载体pET32a(+)中构建重组质粒pET32aLI0710,经双酶切及测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导并经SDS-PAGE检测。结果显示,获得可溶且与硫氧还蛋白-6×His-S标签(Trx-His-S)融合表达的重组FliC蛋白(Trx-His-S-FliC)。采用镍柱亲和层析法纯化Trx-His-S和Trx-His-S-FliC,并分别与猪肠上皮细胞(IPEC-J2)裂解液孵育后,利用anti-His抗体进行免疫共沉淀试验(Co-IP),并对沉淀物利用液质联用串联质谱(LC/MS/MS)技术分析与FliC互作的宿主蛋白,利用Proteome Discoverer 1.4软件在UniProtKB/Swiss-Prot数据库中对互作的宿主蛋白进行肽指纹图谱分析。Co-IP结果显示,检测到了多个与Trx-His-S-FliC互作的宿主蛋白,且通过LC/MS/MS技术共鉴定到50个与FliC互作的蛋白。这些互作蛋白包括蛋白酶、多个核糖体蛋白和线粒体蛋白,广泛参与了细胞质糖酵解、氨基酸代谢、ATP跨膜转运等功能。为了证明质谱数据的可靠性,选择与FliC互作最强的胰蛋白酶经western blot验证,结果显示,胰蛋白酶与FliC蛋白确实存在互作,表明质谱数据可靠。本研究首次鉴定到多个与胞内劳森菌鞭毛蛋白FliC互作的宿主蛋白,为研究FliC蛋白的功能奠定了基础。