鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC的原核表达、纯化及其多克隆抗体的制备

利用PCR扩增出鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白基因fliC,连接到原核表达载体pET28a(+)上,测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞中,构建了原核表达系统。经1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导及Ni-NTA纯化后,得到了带6×His纯化标签的分子质量大小约为54.6kD的表达产物,和预测蛋白大小一致,且大部分表达产物以可溶形式存在利用Western-blotting进一步鉴定,结果表明,该蛋白能与抗His标签的单抗发生特异性反应。用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,获得多克隆抗体,并对抗血清的效价和特异性进行检测,结果表明,多抗的效价较高,特异性较好。

类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FliC与EHEC O157∶H7 EspA蛋白的融合表达及其免疫学性质研究

目的融合表达类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FilC与肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157 EspA蛋白,并评价其免疫学性质。方法 PCR扩增类鼻疽杆菌FilC编码基因bpsl3319,连接到基于EHEC O157 EspA的表达载体pEspA上,表达并纯化EspA-FliC融合蛋白,Western blot分析其抗原性;EspA-FliC免疫Balb/c小鼠评价其免疫原性。结果获得了bpsl3319目的基因,构建了重组表达质粒pEspA-bpsl3319;实现了EspA-FilC的高效表达,其表达量约占菌体总蛋白的25%,纯化后蛋白纯度超过85%。Westernblot结果显示EspA-FliC能分别与抗类鼻疽杆菌多克隆抗体、抗EHEC O157∶H7 EspA的单抗和多抗血清发生特异性抗原抗体反应。EspA-FilC免疫Balb/c小鼠可刺激其产生高效价特异的IgG,且此抗体能识别EspA-FilC、EspA以及天然类鼻疽杆菌的FliC。结论重组表达了融合蛋白EspA-FilC,该蛋白具有较好的免疫反应性和良好的免疫原性。此研究为下一步研制类鼻疽杆菌和EHEC O157的二联疫苗奠定了基础。

5种克罗诺杆菌鞭毛蛋白fliC基因的克隆和序列分析

根据C.sakazakii BAA 894全基因组序列中fliC基因（Gene ID：CP000783.1）,设计特异性引物,通过PCR方法扩增了5种克罗诺杆菌fliC基因的全长序列,并通过生物信息学方法对fliC基因进行了序列分析.序列分析结果表明：fliC基因的全长为837bp,编码279个氨基酸.同源性分析表明：5种克罗诺杆菌fliC基因的序列相似性为92.11%～99.40%;与其它细菌的fliC序列进行比较,其核酸序列同源性为51.73%～82.57%.这表明克罗诺杆菌fliC基因具有较高的保守性,可作为制备克罗诺杆菌多克隆抗体或单克隆抗体的一种候选抗原.

肠炎沙门菌fliC蛋白的表达及ELISA检测方法的建立

为了给临床检测肠炎沙门菌提供一种切实可行的血清学方法,本研究根据肠炎沙门菌(SE)鞭毛蛋白基因(fliC)序列设计一对引物,利用PCR扩增出fliC基因大小为285bp,克隆到表达载体pGEX-4T-1中,成功构建重组质粒pGEX-4T-fliC。将重组质粒pGEX-fliC转化大肠埃希菌DH5诱导表达,通过SDS-PAGE和Western blot分析鉴定,表达的水溶性重组蛋白大小为37ku,有较好的反应原性。以重组蛋白GST-fliC为包被抗原建立间接ELISA检测肠炎沙门菌抗体的方法,为肠炎沙门菌的检测提供一种敏感度高、特异性强的检测方法。