膝关节韧带组织工程的研究进展

目的:对目前膝关节组织工程韧带在体内外的研究进展,应用及价值进行综述。方法:查阅国内外近年来关于组织工程韧带构建治疗膝关节韧带损伤的相关应用文献,对包括种子细胞、生长因子和支架材料三大要素对构建膝关节组织工程化韧带的研究进展进行总结。结果:种子细胞、支架材料的筛选和适当的生长因子是构建膝关节组织工程韧带的核心和必要条件。种子细胞培养条件的优化和生长因子的浓度选择及配比是构建良好组织工程韧带的关键,而实现膝关节组织工程韧带在体内存活和更好发挥生物学效用,仍需进一步研究。随着生物医学及材料科学的发展,膝关节组织工程韧带的构建方法及方式在不断改进。

韧带组织工程中物理环境影响干细胞分化的研究进展

韧带组织工程是目前治疗韧带损伤的一种新型的方法,其可以替代自体移植物的不足。韧带组织工程包括4个基本要素:种子细胞、纳米支架、生长因子、机械刺激。目前韧带组织工程存在的主要问题是如何更可控的使种子细胞向韧带细胞分化。研究发现天然生物韧带的每一个物理特性及机械刺刺激(单轴拉伸)在干细胞向韧带细胞分化中起十分重要的作用,所以纳米纤维支架的设计必须要考虑材料的弹性模量、材料的结构(材料的排列方式、孔隙率及直径等),不同范围内的弹性模量及材料结构会引导细胞向不同谱系分化。考虑到韧带是人体主要的受力组织,所以机械刺激对干细胞分化也是必不可少的,尤其是单轴拉伸,其最符合韧带在体内的受力情况,大量研究发现拉伸的频率、幅度及时间也会引导细胞向不同方向分化。RhoA/卷曲螺旋蛋白激酶对细胞骨架的重构和分化起调节作用,同时研究发现RhoA/卷曲螺旋蛋白激酶蛋白参与了纳米纤维排布及机单轴拉伸引导干细胞向韧带细胞分化的过程,具体是如何影响干细胞分化的,目前并不清楚,了解物理特性对干细胞分化的影响并且弄清RhoA/卷曲螺旋蛋白激酶蛋白的作用机制,将为进一步优化韧带组织工程提供了新的理论依据。

构建韧带组织工程脱细胞支架的可行性研究

背景:十二烷基磺酸钠脱细胞在脱细胞的同时对支架结构存在一定的损伤,降低了支架的生物学性能;胰酶等脱细胞方法较为温和,虽最大程度保留支架结构与生物学性能,但脱细胞效果并不彻底。目的:制备并分析脱细胞牛肌腱作为组织工程韧带支架的可行性。方法:取新鲜小牛跟腱,通过物理法去除肌腱表面腱膜、滑膜及软组织,制备50个跟腱,随机分为两组,均行冻干处理。实验组以Triton X-100行脱细胞处理,对照组不予脱细胞处理。两组均以PBS冲洗后室温干燥备用。行组织学、DNA含量、细胞增殖、生物力学(最大应力、弹性模量以及刚度)检测,比较两组的差异。结果:对照组和实验组的DNA残留量分别为(0.34±0.15)μg/mg和(0.7±0.03)μg/mg,实验组显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验组与对照组支架DNA含量对比显示,支架脱细胞效果彻底,无显著的免疫原性。两组在组织形态结构上无明显差异。细胞增殖显示脱细胞支架对细胞增殖无明显影响。实验组的最大应力小于对照组,弹性模量无统计学差异,刚度试验显示两组无明显差异。结论:脱细胞支架在保留天然支架生物学性能的基础上可作为组织工程支架的选择。

新鲜骨髓吸出物直接种植于支架构建组织工程韧带

背景:有关于应用新鲜骨髓吸出物直接局部注射修复韧带部分损伤的报道,少有提及应用新鲜骨髓吸出物直接种植于支架构建组织工程韧带的研究报道。目的:评价将新鲜骨髓吸出物直接种植于支架构建组织工程韧带的可行性。方法:构建丝素纤维/小肠黏膜下层复合支架后,骨髓种植组将骨髓吸出物直接种植于复合支架上;细胞种植组将骨髓间充质干细胞种植于复合支架上;以未接种任何物质的复合支架作为空白对照,检测各组细胞黏附密度、细胞增殖活性及细胞外基质分泌情况。将骨髓种植组复合物植入兔前交叉韧带横断处,12周后取材评价骨髓种植组材料体内生物相容性。结果与结论:骨髓种植组孵育4 h后的细胞黏附密度、不同时间点细胞增殖率显著高于细胞种植组(P<0.05)。骨髓种植组及细胞种植组Ⅰ型、Ⅲ型胶原分泌量均显著高于空白对照组(P<0.05),但骨髓种植组及细胞种植组两组间Ⅰ型、Ⅲ型胶原分泌量差异无显著性意义。骨髓种植组材料植入兔体内未引起致死性免疫排斥反应及严重炎症反应,未见明显韧带再生及血管化。说明新鲜骨髓吸出物直接种植于支架可构建组织工程韧带,并且体内短期生物相容性良好。

韧带组织工程仿生性支架的研究进展

韧带是致密的纤维结缔组织,通过骨间连接维持关节的稳定性。运动损伤或组织老化引起的韧带撕裂通常需要手术干预,目前使用自体、异体或人工韧带作为移植物进行重建是治疗该类疾病的金标准,但这些移植物都存在诸多弊端。随着材料学和制造技术的发展,以生物支架为基础的工程化韧带组织有望成为新的组织供体,通过模拟天然组织的结构、成分和生物力学性能来达到再生组织的目的。本综述根据近期韧带组织工程的体外和动物实验研究,评估了以仿生性为设计原则,使用不同材料、制造技术和生物因素制造的纤维结构支架、多相界面支架和生物组织衍生支架的各项性能以及在促进韧带修复和重建中的效果。最后,总结并展望未来韧带组织工程研究中生物支架的发展方向。

目前人工韧带与组织工程韧带的研究现状

交叉韧带损伤后,由于其愈合能力较差,因此长期以来,对重建交叉韧带使用材料的研究从未停止过。本文主要对细胞因子在组织工程学韧带中的应用、基因转染技术在组织工程韧带研究中的应用、组织工程韧带附丽的基础研究,骨和组织工程韧带之间的愈合关系作了较详细介绍。另外,对人工合成韧带、胶原支架韧带也作了概述。

组织工程韧带相关研究进展

前交叉韧带（anterior cruciate ligament,ACL）连接股骨与胫骨,主要作用是限制胫骨向前过度移位,维持膝关节的稳定性。ACL极容易部分撕裂或完全断裂而导致疼痛、不适、膝关节不稳和关节松弛,最终引起创伤性骨关节炎[1]。文献研究表明,ACL损伤发生率为35/100000人,其中女性运动员的发生率是男性运动员的2~8倍[2-4]。

中国组织工程韧带研究

韧带由束状致密结缔组织组成,能介导正常的关节运动及维持关节的稳定,韧带损伤后的瘢痕愈合或根本不愈合常导致明显的关节功能丧失,愈合能力较差,学者们对重建交叉韧带的研究从未停止,细胞因子生物材料在韧带修复重建过程中也发挥着重要作用,基因转染是组织工程韧带研究的新技术,这些都为组织工程韧带研究提供的基础依据,人工韧带、胶原支架韧带也为组织工程韧带研究提供更广的思路。

组织工程韧带/肌腱支架材料的研究进展

理想的组织工程韧带和肌腱的支架材料需具备耐受持续的高强度张力、耐磨损性好、无免疫原性、良好的生物相容性及降解性。目前应用于组织工程韧带及肌腱的支架材料主要可分为两大类,天然高分子材料与合成高分子材料。选择合适的支架材料非常关键,它必须具有一定的机械强度及合适的降解速度,才能在完成支架的使命后为正常组织的生长留出空间。本文对这两种材料制备的韧带和肌腱的研究进展作如下综述。

CRTER杂志“软组织工程”栏目关于“组织工程韧带”研究的组稿内容

不同来源的组织工程韧带种子细胞研究 人工韧带与组织工程韧带的研究 组织工程韧带应用于前交叉韧带重建的研究

骨形态发生蛋白9基因修饰人羊膜间充质干细胞体外向韧带成纤维细胞分化研究

目的:探讨骨形态发生蛋白9(BMP9)基因修饰对人羊膜间充质干细胞(h AMSCs)在体外向韧带成纤维细胞(LFs)分化是否有促进作用,并研究其分子机制。方法:体外分离培养h AMSCs及LFs,观察并比较两种细胞形态学差异。经Ad MAX系统体外构建BMP9基因腺病毒载体,经提纯及荧光法病毒滴度测定后转染P3代h AMSCs。实验分为三组,A组:携带绿色荧光蛋白(GFP)的空腺病毒载体转染h AMSCs(h AMSCs-GFP);B组:携带BMP9基因的腺病毒载体转染h AMSCs(h AMSCs-BMP9);C组:韧带成纤维细胞组(LFs)。于体外分别培养7天后使用荧光定量PCR检测并比较各组韧带相关基因Scleraxis(Scx)、Ⅰ型胶原(ColⅠ)、细胞连接素(TNC)、纤维连接蛋白(Fib)及腱调蛋白(Tnmd)m RNA的表达量。使用免疫荧光检测并比较三组细胞体外培养7天后ColⅠ的表达量。结果:在倒置相差显微镜下,h AMSCs原代呈多角形贴壁生长,传代后呈长梭状漩涡状生长。LFs原代呈长梭状贴壁生长,传代后呈漩涡状集落样生长。A、B组细胞转染8 h、24 h后,生长增殖缓慢,轮廓清晰,细胞形态未发生变化。荧光显微镜观察显示A组在转染8 h后可见GFP荧光表达,24 h后表达荧光的数量和强度均增多。实时荧光定量PCR显示,转染7天时B组SCX、Tnmd、ColⅠ、Fib及TNC的表达量均高于A组(P<0.05),而SCX、Fib、TNC及Tnmd的表达量低于C组(P<0.05),ColⅠ的表达量高于C组(P<0.05)。荧光免疫组化显示,转染7天后,B组ColⅠ的表达量均高于A组和C组。结论:BMP9基因可促进h AMSCs向LFs定向分化,并促进韧带特异性基因的表达和细胞外基质的产生,为h AMSCs作为韧带组织工程种子细胞提供了实验基础。

组织工程韧带的研究进展

目的对组织工程韧带的研究进展进行综述。方法广泛查阅近年来有关组织工程韧带构建及其在前交叉韧带(anterior cruciate ligament,ACL)损伤中应用的文献,对构建相关的种子细胞、支架材料、生长因子和力学刺激的研究进展进行总结。结果利用MSCs和ACL成纤维细胞构建的组织工程韧带目前已成功应用于动物实验。选择合适的种子细胞、支架材料、力学刺激及必要的细胞因子是构建良好组织工程韧带的关键。培养条件的进一步优化以及如何实现组织工程韧带在体内更好的存活和转归,尚需进一步研究。结论组织工程韧带构建及其在ACL的修复再生方面取得了巨大进步,随着生物化学及支架材料的发展其有望用于临床。

体外诱导人羊膜间充质干细胞向韧带细胞分化的实验研究

目的探讨人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs)是否具有MSCs的特性及经诱导后在体外能否向韧带细胞分化。方法取产妇胎盘通过酶消化法获得h AMSCs,流式细胞术鉴定h AMSCs表型特征。取第3代h AMSCs分别加入含不同诱导液的L-DMEM/F12培养基:A组TGF-β1+b FGF,B组透明质酸(hyaluronic acid,HA),C组TGF-β1+b FGF+HA,D组为空白对照组。倒置相差显微镜观察诱导后21 d各组细胞形态学变化;磺酰罗丹明B(sulforhodamine B,SRB)比色法检测各组细胞生长活性;诱导后7、14、21 d分别采用免疫组织化学染色及实时荧光定量PCR检测韧带特异性蛋白和基因Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、肌腱蛋白C(tenascin C,TNC)表达。结果流式细胞术鉴定结果表明h AMSCs表达MSCs表型。倒置相差显微镜观察示诱导21 d A、B、C组细胞均呈长梭形纤维细胞样生长,C组细胞形态更单一、有明显方向性且较A组排列更紧凑。SRB比色法检测示各组细胞于培养6 d左右达增殖高峰,6 d时A、B、C组细胞活性均显著高于D组。免疫组织化学结果示:诱导培养7 d,各组均未检测到TNC表达;7、14、21 d A、B、C组Ⅰ型胶原表达均显著高于D组,14、21 d A、B、C组Ⅲ型胶原表达显著高于D组,差异均有统计学意义(P<0.001)。B组Ⅰ型胶原表达以及A、C组Ⅲ型胶原、TNC表达随时间增加均呈逐渐增高趋势,各时间点间比较差异均有统计学意义(P<0.001)。实时荧光定量PCR结果示:诱导培养21 d,C组Ⅰ型胶原、TNC m RNA相对表达量显著高于A、B组,B组Ⅲ型胶原m RNA相对表达量显著高于A、C组,差异均有统计学意义(P<0.05)。A、C组Ⅰ型胶原、TNC以及C组Ⅲ型胶原m RNA相对表达量随时间增加呈逐渐上调趋势,各时间点间比较差异均有统计学意义(P<0.001)。结论 h AMSCs具有MSCs的特性,有良好增殖能力,经体外诱导后韧带特异性基因表达上调,韧带特异性蛋白合成增加,可作为韧带组织工程种子细胞来源之一。

TGF-β_1联合VEGF对人羊膜间充质干细胞向韧带成纤维细胞体外分化作用的研究

目的探讨人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs)是否具有MSCs特性,以及经TGF-β_1和VEGF联合诱导后是否具有向韧带成纤维细胞分化的能力。方法取自愿捐赠的足月产妇胎盘,采用胰蛋白酶胶原酶联合消化法分离培养h AMSCs,流式细胞术检测h AMSCs表型分子,免疫荧光染色检测h AMSCs其角蛋白-19(cytokeratin-19,CK-19)和波形蛋白表达情况。取第3代h AMSCs,分别使用含TGF-β_1和VEGF的L-DMEM/F12成韧带或纤维细胞诱导培养基(实验组)和普通L-DMEM/F12培养基(对照组)培养,细胞增殖-毒性检测试剂盒(cell counting kit-8,CCK-8)检测两组细胞增殖能力;培养5、10、15 d分别采用免疫荧光染色及实时荧光定量PCR检测韧带及血管生成相关特异性蛋白和基因表达。结果倒置相差显微镜观察示h AMSCs呈单层贴壁生长;流式细胞术结果示h AMSCs表达MSCs表型分子;免疫荧光染色示h AMSCs高表达波形蛋白、低表达CK-19;h AMSCs具有向成骨、成软骨及成脂细胞分化的能力。CCK-8法检测示,7 d时两组细胞均达增殖高峰,实验组细胞增殖能力于7 d后显著高于对照组(P<0.05)。免疫荧光染色示,培养5、10、15 d时实验组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白(Fibronectin)、细胞连接素(Tenascin-C)表达染色均较对照组增强。实时荧光定量PCR结果示,随时间延长实验组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Fibronectin、α-肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、VEGF m RNA相对表达量均逐渐上调(P<0.05)。除培养5 d两组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、VEGF m RNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)外,其余各时间点实验组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、Fibronectin、α-SMA和VEGF m RNA相对表达量均显著高于对照组(P<0.05)。结论 h AMSCs具有MSCs特征,且体外增殖能力良好,可作为组织工程种子细胞来源;体外诱导后韧带成纤维细胞及血管生成相关特异性基因表达上调,韧带成纤维细胞特异性蛋白分泌增加,TGF-β_1联合VEGF可作为构建组织工程韧带的生长因子选择。

不同去细胞方法对兔肌腱组织学的影响

组织工程韧带／肌腱是近年研究的热点，理想的组织工程韧带可以保留肌腱／韧带的基本组织结构，提供最佳的干细胞增殖分化环境及肌腱／韧带胶原间的纤维连接，去细胞组织工程肌腱／韧带提供了这种可能，同时避免肌腱／韧带免疫源性及疾病传播风险[1]。

Runx2基因诱导人羊膜MSCs体外向韧带成纤维细胞定向分化及促进兔腱-骨愈合的研究

目的探讨Runx2基因是否具有体外诱导人羊膜MSCs(human amniotic MSCs,hAMSCs)向韧带成纤维细胞分化以及在体内能否促进兔前交叉韧带重建后腱-骨愈合。方法取健康产妇自愿捐赠胎盘分离培养hAMSCs并传代后行流式细胞鉴定。构建携带Runx2基因的腺病毒载体(Ad-Runx2)以及空质粒载体腺病毒(Ad-NC),经病毒滴度测定后分别转染第3代hAMSCs(Ad-Runx2组、Ad-NC组),实时荧光定量PCR及Western blot检测Runx2基因及蛋白表达,验证Ad-Runx2基因转染hAMSCs有效性;然后于转染后培养3、7 d时,进一步采用实时荧光定量PCR检测韧带成纤维细胞相关基因[VEGF、Ⅰ型胶原、纤连蛋白(Fibronectin)和肌腱蛋白C(Tenascin-C)]表达;以单纯hAMSCs作为空白对照组。将单纯hAMSCs以及转染Ad-NC、Ad-Runx2的hAMSCs分别与基质胶(Matrigel)按照体积比1∶1和1∶2混合构建复合物,采用细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK-8)检测细胞增殖,取增殖较好的对应复合物进行后续动物实验。将12只新西兰白兔随机分为假手术组(Sham组)、前交叉韧带重建组(ACLR组)、前交叉韧带重建+Ad-NC组(Ad-NC组)、前交叉韧带重建+Ad-Runx2组(Ad-Runx2组)4组,每组3只。制备前交叉韧带重建模型后,Ad-NC组、Ad-Runx2组于骨道内对应注射最佳hAMSCs-Matrigel复合物。术后1个月取材行大体、组织学(HE染色及天狼猩红染色)、免疫荧光染色观察,评价韧带组织中炎症细胞浸润以及Ⅰ/Ⅲ型胶原、Tenascin-C含量。结果流式细胞鉴定分离培养细胞符合MSCs表型特征。Runx2基因成功转染至hAMSCs;与Ad-NC组相比,Ad-Runx2组转染后VEGF及Ⅰ型胶原基因相对表达量于培养3、7 d时均增高(P<0.05),Fibronectin仅3 d时增高(P<0.05),而Tenascin-C于3 d时增高、7 d时降低(P<0.05)。CCK-8检测示两种比例混合培养后,细胞增殖组间以及组内各时间点间差异均无统计学意义(P>0.05),选择1∶1比例构建复合物进行后续实验。动物实验显示,术后1个月时,大体观察各组移植肌腱连续性完整;HE染色示Ad-Runx2组组织修复情况优于ACLR组和Ad-NC组、炎症细胞更少;天狼猩红染色及免疫荧光染色均示Ad-Runx2组韧带组织的Ⅰ、Ⅲ型胶原纤维增多,趋于形成正常前交叉韧带结构,但Tenascin-C蛋白荧光强度与ACLR组和Ad-NC组相比减弱。结论Runx2基因转染hAMSCs后可诱导其向韧带成纤维细胞定向分化,并促进兔前交叉韧带损伤重建的腱-骨愈合。

脱细胞跟腱复合人成纤维细胞共培养的实验研究

目的探讨脱细胞跟腱的制备及其与人成纤维细胞复合培养效果,为组织工程韧带的构建提供一种支架材料。方法取10只5月龄雄性新西兰大白兔(体重4～5 kg)双后肢跟腱,经胰蛋白酶、Triton X-100、SDS脱细胞处理后,行大体、组织学及扫描电镜观察。将脱细胞跟腱与人成纤维细胞复合培养,于培养1、3、5、7、9 d行细胞相容性检测,并于4周后取材行组织学、扫描电镜观察以及生物力学检测,并与脱细胞前、后跟腱进行比较。结果跟腱经脱细胞处理后腱膜完整,质柔软、韧性好,体积较处理前跟腱显著增大;跟腱腱束间未见疏松结缔组织及腱细胞,胶原纤维排列疏松,呈三维网状分布,腱束间残留较多孔隙;且细胞相容性良好。复合培养4周后,细胞迁移至纤维束间的孔隙内,三维网状结构消失。生物力学测试示,与脱细胞前跟腱组及细胞-支架复合组比较,脱细胞跟腱组拉伸强度及杨氏弹性模量均显著降低(P<0.05),细胞-支架复合组与脱细胞前跟腱组比较差异无统计学意义(P>0.05);各组间断裂伸长率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论兔脱细胞跟腱与人成纤维细胞生物相容性良好,可作为支架材料用于组织工程韧带构建。

骨髓间充质干细胞在腱骨愈合领域研究进展

韧带和肌腱损伤是一种临床常见病、多发病[1].韧带重建术被广泛应用于关节韧带损伤的治疗[2],以避免关节失稳及骨性关节炎等诸多问题[3].为了提高韧带愈合的质量和恢复韧带的正常功能,以转基因技术、合适的种子细胞、合理的支架材料及机械应力等作为基本要素的组织工程韧带在韧带愈合和重建过程中具有巨大的发展潜力,有望解决目前韧带和肌腱修复重建术中产生的诸多问题.在组织工程韧带的构建过程中种子细胞的选择和转化尤为重要,骨髓间充质干细胞（BMSCs）作为一种常用的“干细胞”具有自我更新和多向分化能力.本文对BMSCs在腱骨愈合领域的应用研究作一综述.