柑橘黄龙病菌效应子致病机制研究进展

柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是全世界范围内为害最严重的柑橘病害之一,每年对柑橘生产造成巨大损失,严重影响全球柑橘产业发展。在中国岭南地区,重要药用植物茶枝柑、化州柚、广佛手等均受到柑橘黄龙病的威胁。亚洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)是最常见的柑橘黄龙病致病菌株,该菌定殖于植物的韧皮部,主要感染芸香科柑橘属(CitrusL.)植物。目前尚无体外成功培养亚洲韧皮部杆菌的报道,因此对柑橘黄龙病致病机制研究和黄龙病防治均有较高难度。效应子(又称效应蛋白)是病原菌向宿主分泌的一类致病因子,是病原菌侵染植物的重要武器。效应子能够靶向宿主细胞关键免疫信号转导和调控组分,从而抑制植物防御反应,增强病原菌致病性。柑橘黄龙病菌能够分泌近百个效应子,根据分泌途径的不同,主要分为Sec依赖型效应子和非经典分泌效应子,其中Sec依赖型效应子有90个、非经典分泌效应子有15个。这些效应子在柑橘黄龙病菌侵染宿主过程中发挥关键作用。已有研究发现,黄龙病菌效应子能够靶向包括植物免疫信号转导、细胞自噬、水杨酸信号途径等多个生物学过程,从而干扰宿主柑橘的防御反应,以促进黄龙病菌的定殖。该文结合近年来有关柑橘黄龙病菌效应子致病机制的研究,阐述了柑橘黄龙病研究概况、黄龙病菌效应子的分类,重点综述了影响柑橘防御反应的柑橘黄龙病菌效应子的致病机制,最后展望了黄龙病菌效应子的未来研究趋势和方向,讨论了基于效应子靶标寻找黄龙病重要抗性基因的可能性,期望通过亚洲韧皮部杆菌效应子研究,为柑橘黄龙病致病机制研究和病害防控提供指导。

黄龙病对柑橘叶片同化物积累和矿质养分运输的影响

【目的】探究感染黄龙病柑橘叶片中光合产物积累、矿质元素运转与病菌侵染的内在联系,为通过营养调节防控黄龙病提供理论基础。【方法】柑橘样品采集于位于广西阳朔的中国柑橘黄龙病研究中心,选取柑橘园中长势一致的健康、染病柑橘植株各6株,取中部有6~8个叶片的枝条为试材,分析叶片病原菌数量、叶片温度,枝条同化物运输及分配。采用X射线荧光光谱(XRF)离子显影、定量电感耦合等离子体质谱(ICPMS)法测定叶片养分分布及含量。【结果】韧皮部杆菌(C. Las)侵染柑橘叶片后,主要定殖于叶片中的筛管、伴胞附近(即叶中脉),叶中脉中病菌扩增阈值循环数(cycle threshold,Ct值)显著下降。与健康柑橘叶片相比,染病叶片斑驳黄化,叶绿素含量显著降低,叶片温度显著升高;病叶叶肉、叶中脉、韧皮部中淀粉、可溶性总糖、果糖显著高于健康叶片。营养元素在叶片各部位的聚集发生显著变化,Ca、Fe在叶肉明显聚集,K在叶中脉明显聚集,Zn、Cu、Mn在叶肉明显减少。叶肉中Ca与Cu、Cu与Zn呈显著正相关,叶中脉中Ca与Mn、Cu呈显著负相关,线性混合效应模型中病原菌浓度对K、Ca、Fe、Cu、Mn、Zn影响显著,其中对K、Cu、Mn为正效应,对Ca、Fe为负效应(P<0.05)。【结论】黄龙病病原菌主要定植在叶中脉,导致碳水化合物和Ca、Fe运输受阻,叶肉细胞中叶绿素含量下降,叶肉、叶中脉中淀粉、可溶性总糖含量显著升高。矿质元素间通过协同或拮抗关系平衡柑橘叶片的营养条件,病原菌数量与叶肉中K、Cu、Mn含量为正相关,与Ca、Fe含量为负相关,因此,注意协调Ca、Fe营养可作为抵抗病原菌生长的策略。

广西柑橘黄龙病发生情况及黄龙病菌的遗传多样性分析

【目的】了解广西柑橘主产区黄龙病(Huanglongbing,HLB)危害情况及黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus, CLas)的遗传多样性,为黄龙病的田间诊断和科学防控提供参考。【方法】对广西柑橘主产区8个地级市有代表性的柑橘园进行2个年度(2020和2021年)的跟踪调查并随机采集1048份柑橘叶片样品,利用qPCR技术对采集的样品进行CLas检测,并对阳性样品CLas菌株的基因组高变区的扩增产物进行测序,分析CLas菌株的遗传多样性。【结果】与2020年相比,除采自百色的柑橘样品CLas检出率2个年度保持不变(14.29%)外,2021年采自玉林、桂林、河池、梧州、南宁、贺州和来宾的柑橘样品CLas检出率均呈上升趋势,其中2021年采自梧州的柑橘样品CLas检出率最高(52.94%)。不同种类柑橘的CLas检出率差异明显,2021年甜橙类、柚类、杂交柑类和金柑类的样品CLas检出率均较2020年升高,2个年度的宽皮柑橘类CLas检出率相同(14.29%)。不同症状类型的柑橘样品CLas检出率也存在较大差异,其中2021年采集的缺素黄化型样品CLas检出率最高(61.64%),其次是均匀黄化型(24.00%)和褪绿斑驳型(20.00%),无症状样品的CLas检出率亦高达11.54%,均较2020年的检出率增加。通过对CLas基因组高变区的PCR产物进行测序,发现CLas菌株存在丰富的遗传多样性,37株CLas菌株可聚为7个类群,与寄主柑橘的种类有一定关系,但其与症状类型及地理来源无明显的相关性。【结论】不同年份、地理来源、柑橘种类和症状类型的CLas检出率差异较大,且发病率有逐年上升趋势。田间缺素黄化型植株确诊为感染黄龙病的概率最大,其次是均匀黄化型和褪绿斑驳型,无症状植株也有很大概率感染黄龙病。CLas菌株存在丰富的遗传多样性,与寄主柑橘的种类有一定关系,但与症状类型及地理来源无明显的相关性。

柑桔黄龙病研究的回顾与展望

柑桔黄龙病是由一种叫做韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter)的病原引起的,已经确定的病原有亚洲、非洲和美洲3个种。病害通过种苗、嫁接和木虱介体等途径传播。病害可根据田间症状诊断,也可以通过血清学、电镜技术和PCR等分子生物学等技术进行鉴定。目前,柑桔黄龙病主要依靠综合防治的方法。开展病原的人工培养、抗病育种、致病机理和病害防治方法等方面的研究对揭示病原特性和病害防治等都具有十分重要的意义。

柑橘黄龙病病原培养及分子检测技术研究进展

柑橘黄龙病(Huanglongbing)由韧皮部杆菌属细菌(Candidatus Liberobacter sp.)侵染引起,是柑橘生产上的毁灭性病害,当前正在世界柑橘产区迅速蔓延,已成为制约柑橘产业健康发展的关键因素之一。介绍了柑橘黄龙病的症状以及病原的分离培养研究进展,阐述了病原的分子检测技术,包括PCR、双重PCR、实时荧光定量PCR和LAMP快速检测技术,并对病害的防控进行展望。

广东梅州柑橘黄龙病和病毒病的发生调查及其黄龙病菌原噬菌体多样性

【目的】调查柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)和病毒病在广东省梅州市柑橘主产区的危害情况,分析该地区柑橘黄龙病菌(CLas)的原噬菌体多样性。【方法】以16S rDNA为模板设计引物,利用实时荧光定量PCR(qPCR)检测梅州市不同抽检地在2017-2019年3年间柑橘黄龙病的发病情况;同时分别采用已报道的柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)、柑橘裂皮病毒(Citrus exocortis viroid,CEVd)、柑橘褪绿矮缩病毒(Citrus chlorotic dwarf-associated virus,CCDa V)、柑橘碎叶病毒(Citrus tatter leaf virus,CTLV)和柑橘黄脉病毒(Citrus yellow vein clearing virus,CYVCV)的特异性检测引物,提取样品的RNA,反转后以样品的c DNA为模板,通过普通PCR的方法分析梅州市抽检地区柑橘病毒病的发生情况。此外,以基于2种原噬菌体类型(SC1和SC2)对应的超变异基因区域设计的2对引物(Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2),运用普通PCR方法分析该地区CLas菌株原噬菌体的遗传多样性。【结果】除2018年9月梅州大浦顺兴公司蜜柚基地的抽检样品外,梅州市其他被检地区均发现CLas。总体来说,梅州市的脐橙CLas检出率为55.3%,蜜柚为61.5%,沙田柚为61.7%。其中2017年采集自平原县大拓镇的蜜柚和沙田柚样品CLas检出率为100%,兴宁市白马镇的蜜柚为100%,沙田柚为80%;其他抽检地区的样品CLas检出率在16.7%-83.3%。虽然梅州市部分地区的检出率较高,但其病原菌的含量并不高,大部分处于柑橘黄龙病发病初、中期,属可防可控阶段;此外,梅州市柑橘病毒的总检出率不高,CTV、CTLV和CYVCV为梅州的主要病毒,CEVd和CCDa V没有检测到。CTV、CTLV和CYVCV在脐橙上的检出率依次为78.9%、7.9%和21.1%,蜜柚为15.4%、25.0%和9.6%,沙田柚为6.4%、2.1%和4.3%。基于Lap-TJ-F/Lap-TJ-R1和Lap-TJ-F/Lap-TJ-R2来研究CLas原噬菌体多样性的PCR扩增条带共有4种类型(SC1-1、SC1-2、SC2-1和SC2-2),经过PCR电泳和测序得出,来自梅州市脐橙和沙田柚的CLas菌株以SC2-1型为主,蜜柚上以SC1-1型为主。【结论】梅州柑橘产区的柑橘黄龙病目前属于可防可控阶段,其病原菌菌株的原噬菌体在不同品种上具有其独特性;由于在抽检时发现有柑橘病毒病的存在,因此在种植过程中需加强种苗监管,同时应采取有效措施对柑橘黄龙病和柑橘木虱(Diaphorina citri)进行绿色防控。

柑橘黄龙病菌基因组学的研究进展

柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing, HLB)是柑橘生产上最具毁灭性的病害,严重威胁着世界柑橘产业的发展。该病害由难培养细菌候选韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter spp.)所引起,通过带病苗木和媒介昆虫进行传播蔓延。近年来,随着 DNA 测序技术和生物信息学的发展,基因组学被广泛应用于柑橘黄龙病的研究,并为克服黄龙病菌难培养所造成的研究瓶颈提供了新的方法和思路。柑橘黄龙病菌基因组学的研究,不仅有助于探究黄龙病菌与寄主植物的互作关系,而且可为抗病栽培和病害早期检测提供重要的理论基础。本文结合当前柑橘黄龙病的研究概况、病原全基因组的测序策略及基因组的特征描述,重点综述基因组学在黄龙病致病机理、病原遗传多样性与分子检测等方面的研究进展。

日本柑橘黄龙病病原体电镜观察及PCR检测

对日本柑橘黄龙病病原体的形态结构进行了电镜观察,结果发现柑橘黄龙病病菌日本株系绝大多数是球形和短椭圆形,极少观察到棒状形态,直径为100～500 nm,外被一层胶状物质包围,厚约10～50 nm,这与其他地区发现的柑橘黄龙病病原体形态不同.PCR检测表明,以硅藻土法提取的DNA为模板,利用Ready-To-GoTM PCR bead法可以得到理想结果.

柑桔黄龙病病原遗传多样性研究进展

柑桔黄龙病是世界范围内一种毁灭性的柑桔病害,严重阻碍了柑桔产业的发展。对柑桔黄龙病病原的种群分化及遗传变异进行研究,有助于了解柑桔黄龙病流行、起源与进化。近年来柑桔黄龙病病原遗传多样性研究已成为热点之一,本文对国内外在该领域的研究进展进行概述。

柑橘SAR及其信号转导基因CsSABP2在黄龙病菌侵染中的响应特征

【背景】柑橘系统获得性抗性(systemic acquired resistance,SAR)在柑橘抗黄龙病(Huanglongbing,HLB)过程中起着重要作用。水杨酸(SA)和水杨酸甲酯(MeSA)信号互换是激活植物SAR的关键信号转导途径,但其在抗HLB危害中的作用依然不清楚。【目的】以柑橘HLB不同耐病品种为材料,研究柑橘SAR及其信号转导的关键酶基因CsSABP2(salicylic acid binding protein 2)在HLB病原菌‘Candidatus Liberibacter asiaticus’(CLas)侵染中的响应特征,了解柑橘SAR及CsSABP2响应CLas侵染的作用。【方法】从SAR Marker基因CsPR1、CsPR2、CsPR5表达、活性氧H_(2)O_(2)水平和淀粉含量变化等方面分析CLas侵染、外施SA和MeSA调控柑橘SAR的特征。进一步,基于易感HLB锦橙(Citrus sinensis)和耐HLB酸柚(C.grandis)感染CLas转录组测序比较分析,筛选和克隆响应CLas侵染的CsSABP2差异表达基因;生物信息学分析预测差异基因的生物学功能;qRT-PCR分析差异表达基因在锦橙、酸柚和耐HLB马蜂柑(C.hystrix)中响应CLas感染的表达变化;以锦橙叶片为试材分析差异表达基因响应外源SA和MeSA诱导的表达特征。【结果】SAR Marker基因响应CLas表达分析表明,CsPR1、CsPR2和CsPR5均正向响应CLas侵染上调表达,CsPR2和CsPR5在酸柚和马蜂柑中表达水平高于锦橙,特别是叶肉中两个基因的表达水平均显著高于锦橙;相反,CsPR1在叶脉中上调表达水平明显高于叶肉,且在锦橙叶脉中表达水平显著高于酸柚和马蜂柑叶脉中。离体模拟SA和MeSA调控柑橘SAR反应显示,与SA处理相比,MeSA处理明显诱导CsPR1、CsPR2和CsPR5上调表达,同时非处理部位基因(特别是CsPR5)表达水平也明显上调。H_(2)O_(2)检测结果表明,外源MeSA诱导非处理部位H_(2)O_(2)积累显著强于SA。同时,通过对外施MeSA、SA的感病叶片进行连续5周的淀粉含量检测,发现MeSA能明显减少感病叶片中淀粉的积累。进一步转录组数据和生物信息学分析表明,4个SAR关键调控基因CsSABP2-1、CsSABP2-2、CsSABP2-3、CsSABP2-4显著响应CLas侵染而差异表达,且编码蛋白质均含SABP2水解活性必需的保守结构域。qRT-PCR结果表明,CsSABP2-1、CsSABP2-4在耐病品种酸柚和马蜂柑中受CLas诱导高水平表达且在叶脉中的表达水平高于叶肉;CsSABP2-2和CsSABP2-3表达水平变化不明显。激素诱导结果显示,CsSABP2主要响应MeSA的诱导表达,MeSA显著诱导CsSABP2-2高水平表达(>10倍),且显著下调CsSABP2-1和CsSABP2-4的表达(下调至0 h表达量的15%—55%)。【结论】耐病品种酸柚和马蜂柑SAR响应CLas的反应明显强于易感病品种锦橙,且MeSA在介导柑橘SAR抗病反应中起正向调控作用。SA与MeSA信号转导的关键酶基因CsSABP2-1和CsSABP2-4在柑橘SAR响应CLas侵染中起着重要作用,其高水平表达与柑橘HLB抗性紧密相关;而且CsSABP2-1、CsSABP2-2、CsSABP2-4在调控SAR应答柑橘CLas侵染中可能起着关键的协同作用。

马蜂柑响应黄龙病菌不同侵染时期的生物学和转录组学分析

【目的】柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是制约柑橘产业发展的重大病害,我国发生的黄龙病由韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)引起。本研究通过分析潜在耐黄龙病柑橘品种马蜂柑(Citrus hystrix)在感染黄龙病后不同时期的生物学症状、显微结构和转录组学差异,揭示马蜂柑不同时期对黄龙病菌具有耐性的分子机理,为进一步深入挖掘抗性基因及开展抗病育种打下基础。【方法】以嫁接在两年生卡里佐枳橙砧木上的马蜂柑作为供试材料,使用只感染CLas、其他常见柑橘病毒类病原均呈阴性的毒源为接毒材料对马蜂柑进行接种,并在接种毒源后每隔15 d进行定期的荧光定量PCR检测。将马蜂柑接种毒源4个月(最早检测到CLas阳性)作为感病前期处理,接种毒源14个月作为感病后期处理,以健康植株为对照,进行生物学症状和显微结构观察,分析其感病后不同时期的结构变化。结合比较转录组学分析与荧光定量PCR验证,解析其耐病相关机制。【结果】症状观察发现,马蜂柑在感病前期和感病后期,植株叶片几乎不显症;显微结构观察表明,马蜂柑在感病前期中脉组织结构清晰,细胞形态正常,无淀粉粒积累的现象,仅在后期出现韧皮部极少数的筛管被堵塞;对转录组测序结果进行筛选鉴定,马蜂柑感病前期共筛选鉴定到181个差异表达基因,感病后期共筛选鉴定到1384个差异表达基因;比较转录组分析表明,马蜂柑感病前期和后期的差异表达基因主要涉及细胞壁代谢、防御反应、淀粉与蔗糖代谢、胼胝质合成以及信号转导等方面,其中在感病前期,淀粉与蔗糖代谢、细胞壁代谢相关的调控基因下调表达,在感病后期,水杨酸代谢及其信号转导途径、病程相关蛋白和谷胱甘肽转移酶相关的调控基因上调表达。【结论】马蜂柑响应CLas早期侵染主要表现为物理结构稳定、淀粉合成和光合作用等途径不受干扰;而水杨酸介导的抗性信号转导、效应蛋白触发免疫反应(effector-triggered immunity,ETI)激活的病程相关蛋白和谷胱甘肽转移酶参与的解毒作用是感病后期的主要耐病机制。

黄龙病菌在4个品种柑橘果枝内的时空分布

【目的】亚洲种韧皮部杆菌(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)是引起柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)的优势种,也是引发我国柑橘HLB的唯一病原菌。探索CLas在柑橘果枝内的时空分布规律,有利于及时准确地对其进行检测,对HLB的防控具有重要意义。【方法】以砂糖橘、W.默科特、红心蜜柚和沙田柚不同生长期的果枝为材料,利用实时荧光定量PCR检测果枝CLas含量,研究其时空分布规律。【结果】CLas在病枝中分布不均匀,在果实处(橘络、果中轴或种皮)富集。对于宽皮柑橘的砂糖橘和杂柑的W.默科特,成熟期果实橘络中的CLas含量最高;而对于柚类的红心蜜柚和沙田柚,成熟期果轴中的CLas含量最高。砂糖橘果实膨大与成熟过程中,CLas随着营养物质的流动从源器官(叶片)向库器官(果实)分流并聚集;果轴和橘络中的CLas含量不断增加,且橘络中的CLas含量显著上升。【结论】CLas随着柑橘果实生长和成熟而汇集,结合源库理论可解析CLas在果枝上的运转和分布规律。

携带不同原噬菌体的黄龙病菌在柑橘木虱体内的增殖及致病力

【背景】在中国,柑橘黄龙病(citrus Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)所引起的一种毁灭性病害,严重威胁着柑橘产业的可持续发展。前期研究表明CLas全基因组上鉴定出3种单独类型的原噬菌体基因序列,而广东黄龙病菌主要以Type-2原噬菌体类型和Type-1+3混合原噬菌体类型为主。这两种CLas菌株在传病媒介——柑橘木虱(Diaphorina citri)体内的增殖及其对寄主植物的致病力差异依然不清楚。【目的】比较Type-2-CLas菌株和Type-1+3-CLas菌株在柑橘木虱体内的增殖能力和对砂糖橘(Citrus reticulata Blanco cv.Shatangju)的致病力差异。【方法】嫁接准备含有不同CLas菌株的砂糖橘,分别将50头柑橘木虱若虫和50头成虫放置到含有不同CLas菌株的砂糖橘嫩梢上刺吸获菌6、12、18 d,利用荧光定量PCR检测并统计柑橘木虱若虫期、成虫期对Type-2-CLas和Type-1+3-CLas的获菌率和获菌量差异。饲养分别携带Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的柑橘木虱种群,分别将携带Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的20头柑橘木虱成虫置于健康砂糖橘嫩梢上刺吸2周,移除木虱后统计柑橘木虱获菌率和获菌量,每月追踪砂糖橘症状变化和叶片病菌浓度,利用光学显微镜观察接种360 d时叶片韧皮部和薄壁细胞形态学变化情况。【结果】柑橘木虱以若虫形态对Type-2-CLas和Type-1+3-CLas菌株的获菌率和获菌量无显著差异,但柑橘木虱以成虫形态对Type-2-CLas的获菌率和获菌量显著高于Type-1+3-CLas菌株。在虫传后120 d时接种Type-2-CLas菌株的叶片附近新叶会呈现更严重的斑驳症状。Type-2-CLas菌株侵染砂糖橘一年后抽出的新叶转绿不正常,出现均匀黄化、小叶的明显症状,而Type-1+3-CLas菌株新叶症状则为典型斑驳和革质化。叶片解剖观察结果发现,在叶片病菌浓度相近的情况下,相比于接种了Type-1+3-CLas的叶片,接种了Type-2-CLas菌株的叶片韧皮部细胞发生更严重的细胞塌缩,在叶脉和叶肉薄壁细胞内造成较多的淀粉粒积累。【结论】Type-2-CLas比Type-1+3-CLas更容易在柑橘木虱成虫体内增殖,且达到较高的病菌浓度,间接证明了Type-2-CLas菌株具有高传染性。感染Type-2-CLas的新叶呈现均匀黄化、叶小的症状,而感染Type-1+3-CLas的新叶呈现较为斑驳和革质化的症状,Type-2-CLas比Type-1+3-CLas造成更严重的叶脉韧皮部塌缩和淀粉粒积累情况,说明Type-2-CLas比Type-1+3-CLas对柑橘具有更强的致病力。

江西省吉水县柑桔黄龙病菌检测

为了确切诊断江西省吉安市吉水县近年出现的疑似柑桔黄龙病,2019年12月从该县6个柑桔园中共采集12份(株)叶片样品,采用PCR和序列测定技术对叶样进行黄龙病菌检测。结果,从6份样品中检测到柑桔黄龙病菌亚洲种,即亚洲韧皮部杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)。表明吉水县已有柑桔黄龙病发生。

膜吸附法结合可视化环介导等温扩增技术检测柑橘黄龙病菌

【背景】柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是由候选韧皮部杆菌亚洲种(‘Candidatus Liberibacter asiaticus’,CLas)侵染引起的一种柑橘病害。对于该病害的防治主要采取综合措施,包括实施检疫、种植无病苗木、及时挖除病树和集中大面积联防联控柑橘木虱等。前3种方法都需要依靠准确的柑橘黄龙病诊断技术。【目的】利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP),结合膜吸附法DNA快速提取和Gelgreen荧光染料可视化,建立黄龙病田间核酸快速检测方法。【方法】以黄龙病菌β-操纵子与原噬菌体DNA聚合酶基因为模板设计LAMP特异性引物,包括外引物F3/B3、内引物FIP/BIP、环引物LoopF/LoopB和茎引物StemF/StemB。通过对环引物和茎引物设定不同的用量组合,对LAMP引物体系进行优化,确定合适的引物浓度。用优化后的LAMP引物体系对188份田间柑橘叶片进行检测,并构建受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线分析实时荧光LAMP(qLAMP)在CLas检测上的准确性。对qLAMP预混反应液进行两步的常温干燥,分别设定不同的存放条件,评估LAMP常温干燥试剂的稳定性。用本研究建立的CLas可视化LAMP快速检测方法,对田间71个柑橘叶片样品和35个柑橘果实样品进行检测,与实时荧光定量PCR(qPCR)比较两者的符合率。【结果】在LAMP体系中加入环引物、茎引物或增加其浓度都能促进反应速率的提升,并且同时加入终浓度均为1.6μmol·L-1的环引物和茎引物能进一步提高LAMP反应速率。LAMP预混液通过两步法干燥在不同温度存放1—4周均能保持反应活性基本不变,表明制备的两步法干燥LAMP试剂检测性能较好,在低温和常温环境下的稳定性尚可,仅35℃高温存放会略微增加LAMP试剂的反应时间。使用孔径0.1μm尼龙膜代替纤维素滤纸作为核酸吸附材料能提升CLas快速诊断技术的灵敏度。结合DNA快速提取和可视化LAMP建立的CLas快速核酸诊断方法最低能检测到浓度为102 copies/μL的重组质粒样品,总体准确率高。经配对卡方检验,该方法的诊断结果与qPCR无显著差异。可视化LAMP快速检测相较常规检测有着更低的成本和耗时,而且可视化LAMP快速检测无需离心机和PCR仪等昂贵的仪器,仅需一台65℃恒温设备即可。【结论】建立的CLas快速核酸检测方法成本低,30 min即可观察到检测结果,操作简便,准确性高,可替代qPCR在田间进行黄龙病的快速鉴定。

亚洲柑橘木虱带菌率的周年变化动态

目前,柑橘黄龙病(Huanglongbing,HLB)是世界上最具毁灭性的柑橘病害,柑橘黄龙病媒介昆虫—亚洲柑橘木虱的防治是黄龙病防控的重点。在柑橘萌芽期,抽发的嫩芽可以为亚洲柑橘木虱提供丰富的食料并有利于其产卵,导致该时期亚洲柑橘木虱虫口量较大,所以亚洲柑橘木虱防治重点往往在春梢和秋梢期采用化学防治手段进行。本研究采用qPCR技术检测与分析1年来浙江黄岩地区感染黄龙病的柑橘树不同月份携带Candidatus Liberibacter asiaticus(Las)菌量的变化,显示感染黄龙病的橘树1年内Las带菌量不断变化,其Las带菌量全年中以12月份为最高,与11月相比差异无显著性(P>0.05),但显著高于其他月份,而其他各月份之间无显著差异。采集了感染黄龙病的橘树上的亚洲柑橘木虱,每月检测其带Las菌的比例,发现亚洲柑橘木虱带菌率在1年之中同样以12月份最高,在P=0.05水平下,12月份亚洲柑橘木虱带Las菌比例显著高于除1月份以外的其他各月份;同时,从亚洲柑橘木虱周年带菌量检测也显示,亚洲柑橘木虱在12月至翌年1月之间平均Las带菌量最高,表明感染黄龙病橘树的Las带菌量直接影响亚洲柑橘木虱的带菌率。亚洲柑橘木虱带菌率越高越容易造成柑橘黄龙病的传播,所以12月至翌年1月份之间为黄龙病传播的高峰期,以柑橘黄龙病防控为目标的亚洲柑橘木虱防治最重要时间为冬季和春季。

基于不同位点的广东省柑橘黄龙病菌种群分子多样性分析

【目的】探究广东省不同地区柑橘黄龙病菌“Candidatus Liberibacter asiaticus”(CLas)的种内遗传结构及遗传多样性情况;评价用多基因位点分析柑橘黄龙病菌遗传多样性的科学性。【方法】基于原噬菌体区域(SC1、SC2和PJXGC)、转座子位点(CLIBASIA_05620~CLIBASIA_05625)和短串联重复序列STR1(CLIBASIA_03080)、STR12(CLIBASIA_01215)6个基因位点的多态性,对来自广东省10个市(县)的176个黄龙病样品进行病原菌遗传多样性分析。【结果】基于噬菌体类型鉴定出6组菌株,其中携带Type II类型原噬菌体的菌株为优势种群(85.23%);基于转座子位点鉴定出4种类型菌株,含有缺失MCLas-A类型转座子的B350片段的菌株为优势种群(76.70%);基于短串联重复序列STR1和STR12分别鉴定出9和10类菌株,且STR1位点上含有3个“CAGT”串联重复的菌株为优势种群(56.82%);STR12位点上多态性条带分布不集中,没有优势条带类型。聚类分析结果表明湛江、茂名和深圳的种群与其他地区种群的差异较大,而清远和梅州的黄龙病菌种群关系较近。【结论】基于不同位点和基于所有位点所得的聚类结果不尽相同,说明利用单个或单种基因位点对黄龙病菌进行种群遗传结构分析具有较大的局限性。

有百年历史的日益严重的毁灭性柑桔病害——黄龙病

黄龙病是柑桔的一种毁灭性病害,已对世界柑桔产业的发展构成严重的威胁,并在慢慢的向新的柑桔种植区蔓延。本文对黄龙病的历史、病原、生物学特性、流行、检测、地理分布和防控措施等做了详细的论述。黄龙病于1919年在中国南方首次报道,现在亚洲、非洲、大洋洲、南北美洲的40多个国家都有黄龙病发生。黄龙病病原是韧皮部杆菌属革兰氏阴性菌,属于难培养细菌,南非的＂青果病＂（greening）、菲律宾的＂斑叶病＂（mottleleaf）、印度的＂梢枯病＂（dieback）、印度尼西亚的＂叶脉韧皮部退化病＂（vein phloem degeneration）都是由该病原菌引起的。黄龙病病原菌属于韧皮部杆菌属（Candidatus liberibacter）,迄今,已知该病原菌有三个种：亚洲种黄龙病菌主要存在于亚洲地区,巴西和美国（佛罗里达）也有分布,非洲种黄龙病菌及其亚种＂capensis＂存在于非洲国家,美洲种黄龙病菌存在于巴西。世界各地的黄龙病症状实质上是相同的。病株叶片斑驳,引起黄梢,是该病早期典型的症状,病树植株矮化,树势衰弱,结果少,果实变小畸形,着色差（青果）,并从果蒂处开始着色（与正常果着色顺序相反）。黄龙病可通过嫁接从柑桔传到柑桔,也可通过菟丝子从柑桔传到长春花。非洲柑桔木虱和亚洲柑桔木虱是天然的传播媒介。黄龙病有两种类型：一种为非洲的热敏感型,由非洲柑桔木虱传播,发病适温为22~25℃;另一种为亚洲的耐热型,由亚洲柑桔木虱传播,可忍受30℃以上的高温。黄龙病病原菌虽可由电镜检出,但是一般用其它的实验方法来进行常规的检测。不宜采用单克隆抗体的酶联免疫吸附检测。比较好的方法是采用DNA探针的斑点杂交试验和利用基于16SrRNA或rplKAJL-rpoBC操纵子序列的特异性引物的各种PCR（常规PCR,巢式PCR,多重PCR）。由于至今黄龙病还无法治疗,现在普遍采用挖除病株结合化学防治传病媒介,以清除感染源进行预防。为了防止黄龙病和柑桔木虱的进一步国际传播,必须制定严格的检疫措施。

芽孢杆菌处理对柑桔苗木黄龙病抑制效果

为探明芽孢杆菌处理对柑桔苗木黄龙病的抑制效果,本研究对复合菌剂进行分离得到单菌落,对No.4菌株进行细菌纯培养鉴定,通过序列测定确定其分类地位,并采用固体发酵方法制备菌剂,用该菌剂对3个品种的盆栽苗木进行灌根处理。结果表明:No.4菌株属芽孢杆菌属,革兰氏染色呈阳性;通过16SrDNA和recA基因测序分析,证明该No.4菌株与贝莱斯芽孢杆菌同源性达93%;该菌剂灌根21次时,‘沃柑’和‘沙糖橘’黄龙病阳性率由处理前的100%分别降低至50%和75%,而对照样品的阳性率均保持不变;No.4菌剂处理能促进‘沃柑’、‘沙糖橘’和南丰蜜橘3个品种的新生根系增多,褐变根系减少;扫描电镜和石蜡切片观察表明:南丰蜜橘韧皮部杆菌造成根系褐变,染病植株根系的表皮细胞易产生木栓化,表皮细胞上翘,内皮层产生空洞,结构破坏;No.4菌剂处理后,病原诱导启动子GST1及转录因子WRKY22和WRKY24基因的mRNA相对表达量提高。可见,No.4菌剂对柑桔苗木黄龙病有一定程度的抑制效果,对褐变根系有明显的缓解作用。

黄龙病菌在柑橘果实橘络中的分布

黄龙病菌(Candidatus Liberibacter asiaticus,CLas)可在柑橘果实橘络中大量增殖。为探究其在染病柑橘果实橘络内的增殖与分布规律,以感染黄龙病的沃柑、脐橙、琯溪蜜柚和沙田柚果实为材料,利用RT-qPCR对果实橘络单位片段(每1.5cm长片段)组织中的CLas含量进行定量分析,同时对感染黄龙病的沃柑和脐橙同一果实橘络不同位置片段中的CLas含量进行定量分析。结果表明,4个品种橘络中的CLas数量存在差异,其中沃柑和琯溪蜜柚橘络平均每1.5 cm片段中的CLas数量显著高于脐橙和沙田柚(P<0.05)。沃柑和脐橙果实同一橘络位于中端或中后端片段组织中的平均CLas显著高于前端(P<0.05),而琯溪蜜柚和沙田柚各部位无差异。CLas在不同品种果实橘络中的丰度差异可能与不同品种橘络中的物质组成有关,而CLas更倾向于在果实橘络中端或中后端组织中增殖的原因可能与营养物质在橘络中的分布有关。