音速波状蛋白促进骨髓间充质干细胞向多巴胺能神经元分化

目的探讨音速波状蛋白(Shh)促进人骨髓间充质干细胞(MSCs)体外定向分化为多巴胺能神经元样细胞的作用。方法体外分离、扩增和鉴定人骨髓MSCs。采用不同诱导方案诱导MSCs向神经元和多巴胺能神经元样细胞定向转化后,进行抗神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异烯醇化酶(NSE)、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺转运体(DAT)等免疫细胞化学染色,并计算阳性细胞百分率。结果实验组诱导后MSCs能分化为具有典型神经元形态的细胞,可见NSE、Nestin、GFAP、TH和DAT等神经细胞标志表达;对照组MSCs细胞形态无明显变化,上述特异性标志物表达均为阴性。实验2组(诱导方案含Shh)与1组(诱导方案不含Shh)的NSE、Nestin、GFAP阳性细胞百分率的差异无统计学意义,但实验2组TH和DAT阳性细胞百分率明显高于实验1组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论Shh可促进MSCs分化为多巴胺能神经元样细胞。

音速波状蛋白与成纤维细胞生长因子-8联合诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为多巴胺能神经元

目的探讨音速波状蛋白(SHH)与成纤维细胞生长因子-8(FGF-8)促进大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外定向分化为多巴胺(DA)能神经元的作用。方法体外分离、扩增和鉴定大鼠BMSCs。碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)预诱导24h后,SHH与FGF-8联合诱导大鼠BMSCs向DA能神经元分化12d,免疫细胞化学和免疫荧光法检测神经巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、酪氨酸羟化酶(TH)、囊泡单胺转运体(VMAT2)、增殖细胞核抗原(PCNA)、Bcl-2、细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)2、细胞周期蛋白(Cyclin)B1的表达。结果诱导后大鼠BMSCs能分化为具有典型神经元形态的细胞,PCNA、CDK2、CyclinB1表达降低,高表达Nestin、NSE、TH和VMAT2,低表达GFAP。诱导后大鼠BMSCs与对照组BMSCs的TH阳性率分别为(46.7±3.3)%和(3.6±2.2)%(P<0.01)。结论 SHH与FGF-8可以在体外诱导大鼠BMSCs定向分化为DA能神经元样细胞。

Sonic Hedgehog信号通路分子及胰岛素增强子结合蛋白在小鼠胚胎心流出道发育的早期表达

目的探讨胰岛素增强子结合蛋白(ISL-1)及音速波状蛋白(Sonic Hedgehog,Shh)信号通路分子在小鼠胚胎心流出道的早期表达特点与其发育的关系。方法取胚龄8-13 d小鼠胚胎心脏40例制作连续石蜡切片,应用抗音速波状蛋白(Shh)、抗Smoothened(Smo)、抗Patched(Ptc1)、抗Patched 2(Ptc2)、抗ISL-1、抗心肌肌球蛋白重链(MHC)、抗α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体进行免疫组织化学及免疫荧光化学染色。结果胚龄8-9 d,Shh阳性表达于前肠腹侧内胚层,Ptc1和Ptc2在心管心肌呈较强阳性表达,ISL-1阳性细胞自心包腔背侧壁、前肠两侧间充质延伸至心管动脉端。胚龄10-13 d,前肠内胚层向腹侧延伸形成喉气管沟,并呈Ptc1和Ptc2强阳性表达,ISL-1和Smo双阳性细胞围绕喉气管沟形成对称的锥体形结构,其顶端突入动脉囊腔,形成主肺动脉隔,随发育进行,主肺动脉隔由ISL-1阳性表达逐渐转为α-SMA强阳性表达,并将动脉囊分隔为MHC阴性的心包内升主动脉和肺动脉干。结论 Shh信号通路与ISL-1阳性细胞共同参与小鼠胚胎心流出道的正常形态发生。

参附注射液对阿尔茨小鼠认知功能的改善作用及机制

目的探讨参附注射液对阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)小鼠认知功能的改善作用及其作用机制。方法将60只C57BL/6小鼠按照随机数字表法分为正常组、AD模型组、参附注射液(低、中、高)剂量组、音速波状蛋白(sonic hedgehog,SHH)信号特异性抑制剂环巴胺(cyclopamine,CPA)组。采用皮下注射D-半乳糖和腹腔注射东莨菪碱法诱导构建AD小鼠模型。造模开始后参附注射液低、中、高剂量干预组分别按体重10、15、20 mL/(kg·d)给予参附注射液灌胃,共8周;CPA干预组小鼠按体重20 mL/(kg·d)给予参附注射液灌胃,同时按体重5 mg/kg腹腔注射CPA。采用跳台实验、避暗自动测试仪检测小鼠的记忆功能;采用脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法试剂盒(TUNEL)染色检测脑组织细胞凋亡率;采用ELISA法测定各组小鼠脑组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平;采用免疫组化检测脑组织β淀粉样蛋白(amyloid-beta peptide,Aβ)的表达,采用Western blot法检测各组小鼠脑组织中SHH、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和B细胞白血病-淋巴瘤-2相关蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)的表达。结果与正常组相比,AD模型组、参附注射液(低、中、高)干预组、CPA干预组小鼠的记忆潜伏时间、脑组织SOD水平、SHH和Bcl-2的表达明显下降(均P<0.05),错误次数、神经细胞凋亡率、脑组织MDA水平、Aβ和Bax表达明显升高(均P<0.05);与AD模型组相比,参附注射液(低、中、高)剂量组、CPA干预组小鼠的记忆潜伏时间、脑组织SOD水平、SHH和Bcl-2表达升高(均P<0.05),错误次数、神经细胞凋亡率、脑组织MDA水平以及Aβ和Bax表达明显降低(均P<0.05),且具有明显的剂量依赖性(均P<0.05),CPA能部分逆转参附注射液对脑组织的保护作用(均P<0.05)。结论参附注射液能明显降低脑组织的氧化应激,下调脑组织神经元的凋亡率,缓解AD小鼠的脑损伤,其作用机制可能与激活SHH信号有关。

芪术颗粒对大鼠肝缺血/再灌注损伤中SHH信号的影响机制

目的探讨芪术颗粒(QZG)对肝组织缺血再灌注损伤(I/R)中胚胎发育相关音速波状蛋白(SHH)信号的影响机制。方法动物实验:构建大鼠肝脏I/R模型,分为假手术(Sham)组、I/R组、I/R+QZG处理(I/R+QZG)组、I/R+QZG+SHH信号抑制剂环巴胺(CPA,I/R+QZG+CPA)组、I/R+CPA(I/R+CPA)组;检测各组血清中丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天冬氨酸氨基转移酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量。TUNEL染色检测肝组织细胞凋亡;细胞实验:构建大鼠正常肝细胞BRL-3A氧葡萄糖剥夺/再灌注(OGD/R)损伤模型分为正常细胞(Control)组、模型(OGD/R)组、OGD/R+CPA组、OGD/R+QZG组、OGD/R+QZG+CPA组。噻唑蓝(MTT)法检测各组细胞的生长活性;Hoechst 33258染色检测各组细胞凋亡率;Rh123染色检测各组细胞线粒体膜电位;Western印迹检测SHH、SHH通路膜受体蛋白(SMO)、B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)蛋白表达。结果QZG能明显降低实验动物血清中ALT和AST活性,明显降低白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α和MDA含量、肝组织及模型细胞中Bax蛋白表达,明显升高SOD活性、模型细胞生长活性及线粒体膜电位和肝组织及模型细胞中SHH、SMO、Bcl-2蛋白表达,并且明显抑制肝组织和模型细胞凋亡;CPA均可部分逆转这些作用,差异均具有统计学意义(均P<0.05)。结论QZG能改善肝组织中线粒体功能,抑制细胞凋亡,减轻大鼠肝组织I/R后的病理损伤和超微结构损伤,这些可能与激活SHH信号有关。