云南省烟草丛顶病发生规律及其综合防治

烟草丛顶病在云南西部烟区暴发流行,给烟叶生产带来严重损失,是烟草最主要的病害之一.目前烟草丛顶病得到了有效控制,但仍是烟区潜在的危险性病害.本文对烟草丛顶病的危害特征、发病症状、病原物、流行发病规律和综合防治研究进展进行了综述,提出了烟草丛顶病综合防治集成技术,可为进一步研究和防治烟草丛顶病或类似病害提供参考.

2012年-2022年TBTV、TVDV、TBTVsatRNA和TVDVaRNA在云南主要烟区的发生与分布

烟草丛顶病(tobacco bushy top disease,TBTD)是一种由烟草丛顶病毒(tobacco bushy top virus,TBTV)及其卫星RNA(tobacco bushy top virus satellite RNA,TBTVsatRNA)和烟草扭脉病毒(tobacco vein distorting virus,TVDV)及其伴随RNA(tobacco vein distorting virus associated RNA,TVDVaRNA)共同侵染引起的危险性病害,曾在云南很多烟区造成严重损失。本研究对烟草丛顶病及其相关病原物在云南烟草上的发生情况进行了多年的调查研究,力图对烟草丛顶病及其相关病原物的发生与分布进行追踪和分析。结果表明,2012年-2022年,烟草丛顶病在云南各大烟区仅零星发生,2019年以来已很难发现。烟草丛顶病的相关病原物主要在曾经暴发流行过病害的楚雄、保山和大理发现,且TBTV、TVDV、TBTVsatRNA和TVDVaRNA在烟草上并不总是同时被检出,其中引起烟草丛顶病典型症状的TBTV+TVDV+TBTVsatRNA+TVDVaRNA检出率在5%以下,TVDV的检出率最高,达30.44%,TBTVsatRNA的检出率最低,为7.68%。TBTV、TVDV、TBTVsatRNA和TVDVaRNA不能同时感染同一烟株可能是当前烟草丛顶病很少发生的主要原因。

烟草扭脉病毒云南分离物rtp基因克隆及序列分析

探究来自云南不同时间和不同地区的烟草扭脉病毒(TVDV)各分离物间rtp基因序列差异,分析烟草丛顶病近年在田间发生趋势减缓的原因.以2020—2022年从云南楚雄、大理、保山及红河采集的染病烟草样品为材料,对TVDV的rtp基因进行扩增和序列分析,共得到TVDV 7个不同分离物的rtp基因序列,长度均为2172 nt,包含618 nt的cp基因及1554 nt的rtd区;推导的TVDVRTP蛋白共编码722个氨基酸,其中包含CP蛋白的205个氨基酸,RTD的517个氨基酸.多重序列比对结果发现,获得的7个TVDV分离物与GenBank上登录的其他TVDV分离物间cp基因核苷酸序列一致性为98.71%~100%,不同TVDV分离物间CP蛋白的氨基酸序列一致性为98.05%~100%,存在4个氨基酸的差异.获得的7个TVDV分离物与GenBank数据库登录的其他TVDV分离物间rtd区核苷酸序列一致性为96.68%~99.81%,RTD蛋白的氨基酸序列一致性为96.52%~100%,存在39个氨基酸的差异.这些TVDV分离物rtp基因的变异可能会对TVDV的蚜虫传播效率产生影响,进而影响到烟草丛顶病在田间的发生与流行.

烟草丛顶病研究进展

烟草丛顶病是一类在局部地区产生严重危害的烟草病害,由烟草丛顶病毒和烟草扭脉病毒复合侵染引起。目前该病在我国仅云南有发生的报道,烟草丛顶病也是国内第一个报道的由幽影病毒属成员引起的病害。本文较为系统全面地综述了烟草丛顶病的发生与分布、病害症状学、病原物、与病害相关的dsRNA、病组织超微病变以及病害的流行及控制等方面的研究进展。

CTAB法用于染病烟草植株中烟草丛顶病毒RNA的提取

CTAB法是一种广泛用于从染病植物中提取总核酸,并用于后续相关病原物PCR检测的核酸提取法,已普遍运用于DNA病毒、植原体、细菌、真菌侵染植物的总DNA提取和病原检测。本文尝试将CTAB法用于一种由RNA病毒(烟草丛顶病毒)引起的烟草丛顶病染病组织总核酸的提取,以总核酸进行烟草丛顶病毒的RT-PCR检测,并与常规RNA病毒核酸提取法——Trizol法作比较。结果表明CTAB法和Trizol法提取的核酸用于烟草丛顶病毒RT-PCR检测时,均能扩增到目的条带,检测结果一致。在对复合侵染材料进行检测时发现,CTAB法提取的染病植物组织总核酸既包括DNA也包含RNA,有利于对DNA和RNA病原物同时进行检测;CTAB法所用试剂较Trizol法便宜,毒性小,且提取的核酸量较多、保存时间较长。因此CTAB法是一种高效、简便、经济的从烟草丛顶病染病组织中提取烟草丛顶病毒RNA的方法。

一种改进的烟草丛顶病快速诊断方法

与病害特异的小分子RNA的检测是烟草丛顶病的主要诊断方法。本文报道了一种改进的与烟草丛顶病相关的小分子RNA的简便提取方法,在烟草丛顶病的快速、特异检疫中具有较好的应用前景。

从烟草丛顶病病原复合物中分离烟草扭脉病毒的方法

烟草丛顶病是由烟草丛顶病毒（TBTV）、烟草丛顶病毒类似卫星RNA（Sat-TBTV）、烟草扭脉病毒（TVDV）和烟草扭脉病毒相关RNA（TVDVaRNA）复合侵染引起的一类特殊病害,目前尚不清楚这些病原物各自在病害症状形成和病害传播中的作用。本文根据蚜虫传播烟草丛顶病复合病原物传毒特性的差异,探索了3种分离TVDV的生物学方法。方法A为将获得了烟草丛顶病复合病原物的蚜虫饥饿24h后,以单虫单苗的方式接到健康烟株上传毒,24h后灭虫。方法B为将无毒蚜虫饥饿2-4h后转接到感病烟株上饲毒48h,再以单虫单苗的方式接到健康烟株上传毒,24h后灭虫。方法C为将无毒蚜虫于感病烟株上饲毒48h后,以单虫单苗的方式接到健康烟株上传毒24h,此后每隔24h将蚜虫移到另一健康烟株上传毒,直到蚜虫死亡。其中方法 A和B均可将TVDV从烟草丛顶病病原复合体中分开,方法A操作简单、分离周期短且TVDV的分离效率高。单独TVDV侵染的烟株无明显的丛顶症状,叶片靠近主脉的地方会出现皱缩,生长后期叶片变得细长且顶端会发生扭曲。本试验可为研究TVDV与其他病原物、寄主植物和传播介体的相互作用提供很好的试验材料,也可为蚜虫传播的复合侵染病毒的生物学分离提供参考。

烟草丛顶病毒完整基因组上微卫星分布

为了提取并展示NCBI数据库中烟草丛顶病毒完整基因组(NC-004366.1)上微卫星分布特性,采用MATLAB软件和最优完全子图算法自编了计算机程序进行。结果表明,烟草丛顶病毒完整基因组上n-碱基组(n=1～6)最大的重复出现次数随n增加而按指数函数减少。

烟草丛顶病在中国的发现及研究进展

烟草丛顶病是发生在云南西部烟草种植区的一种严重病害。1993年首次在保山地区暴发流行。截止1998年发病面积达5万多公顷,直接经济损失2.1亿元。课题组采用生物学和分子生物学研究方法,明确证实在滇西三江流域烟草种植区普遍爆发流行的此类烟草病害与津巴布韦发生的烟草丛顶病为同一病害。病害由烟草丛顶病毒(TBTV)和烟草脉扭病毒(TVDV)复合侵染引起,是烟草丛顶病在中国的首次报道;获得了TBTV的全长核苷酸序列,是国际上完成的第一个烟草丛顶病毒全序列;开展了TVDV的分子生物学研究并获得了基因组部分序列;报道了TBTV的似卫星RNA,并获得了其部分序列;建立了包括TBTV、TVDV以及TBTV似卫星RNA的烟草丛顶病分子检测体系;通过对病害传播途径、流行规律研究,提出了“预防为主,避蚜防病”的综合防治措施,在全省累计示范推广8万多hm2,平均防治效果在90%以上,挽回烟叶损失1.7亿元,经济效益极为显著,挽救了滇西烟区烟草种植业。

烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物基因组全长序列测定和结构分析

[目的]对烟草丛顶病伴随RNA(TBTDaRNA)临沧分离物基因组全长序列进行测定,并对其进行结构分析。[方法]应用RT-PCR方法扩增烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物的基因组,并进行全长序列的测定,同时对烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物和龙陵分离物的基因组进行比较分析。[结果]烟草丛顶病伴随RNA临沧分离物和龙陵分离物的基因组全长序列一致性为95.4%;ORF1a编码产物的氨基酸序列一致性为93.1%;ORF1b编码产物的氨基酸序列一致性为98.3%;3'端非编码区的核苷酸序列一致性为95.5%。[结论]该研究为研究TBTDaRNA的分子变异奠定了基础。

烟草丛顶病毒ORF3的克隆及原核表达

利用RT—PCR方法，自烟草丛顶病毒（Tobacco bush top virus，TBTV）龙陵分离物（TBTV—YLLi）的RNA中扩增出ORF3目的片段，并克隆到pMD18-T载体上进行序列分析．结果表明，TBTV-YLLi的ORF3全长714bp，与TBTV其他分离物的核苷酸相似性和氨基酸相似性分别为98．3％～98．6％和95．4％～95．8％；与同属的花生丛簇病毒（Groundnut rosette virus，GRV）、豌豆耳突花叶病毒2号（Pea enation mosaic virus-2，PEMV-2）和胡萝卜拟斑驳病毒（Carrot mottle mimic virus，CMoMV）的核苷酸相似性分别为65．1％、61．6％和49．7％，氨基酸相似性分别为36．4％、34．6％和16．5％．将ORF3克隆到原核表达载体pET28a（＋）上，获得的重组子pET28-ORF3转化大肠杆菌BL21-plysS，使用终浓度为1．0mmol／L的IPTG在37℃诱导培养4h时，该融合蛋白表达量最高．融合蛋白经Ni^2＋亲和柱层析纯化后，SDS—PAGE电泳表明，融合蛋白相对分子质量约为35000，与预计的相对分子质量大小相一致．

津巴布韦烟草丛顶病病原物的分子鉴定

【目的】鉴定津巴布韦烟草丛顶病病原复合体组成。【方法】采集津巴布韦烟草丛顶病样品,对其病原复合体进行分子鉴定。【结果】烟草丛顶病毒津巴布韦分离物(tobacco bushy top virus-Zimbabwe,TBTV-Zimbabwe)在基因组RNA核苷酸序列水平上与幽影病毒属(Umbravirus)其他成员的一致性为47.8%~94.6%,其中与埃塞俄比亚烟草丛顶病毒(Ethiopian tobacco bushy top virus,ETBTV)序列的一致性最高,为94.6%;与中国烟草丛顶病毒(tobacco bushy top virus,TBTV)序列的一致性仅为56.9%。分子系统进化分析表明:该病毒分离物与ETBTV同源性最高,为ETBTV的分离物,与TBTV为不同的病毒种。TBTV-Zimbabwe卫星RNA与ETBTV卫星RNA在基因组全长核苷酸序列水平上的一致性为93.9%,与GenBank数据库中除ETBTV卫星RNA之外的其他序列无同源性。研究还获得了津巴布韦烟草丛顶病病原复合体中马铃薯卷叶病毒(potato leafroll virus,PLRV)外壳蛋白基因部分核苷酸序列。【结论】津巴布韦烟草丛顶病病原复合体包含3种病毒组分,它们分别与埃塞俄比亚烟草丛顶病病原复合体的3种组分在病毒种的分类水平上一致。津巴布韦与中国烟草丛顶病病原物差异较大。

与云南烟草丛顶病害病原相关的病毒粒体性质的初步研究

目的 对与云南烟草丛顶病害病原相关的病毒粒体进行初步定性。方法 应用电子显微镜、PAGE -SDS电泳和甲醛变性电泳。结果 发现该病毒为一直径在 2 6nm左右的球状粒体 ,病毒外壳由 1种分子量在 5 5kDa左右的蛋白组成 ,病毒壳内核酸由 3种RNA组成。

云南烟草丛顶病复合病原物的寄主范围

云南烟草丛顶病是由烟草丛顶病毒(TBTV)、烟草扭脉病毒(TVDV)、烟草丛顶病毒类似卫星RNA(Sat-TBTV)以及烟草扭脉病毒相关RNA(TVDVaRNA)复合侵染引起的一种危险性烟草病害。利用带毒烟蚜(Myzus persicae)对12种植物进行蚜虫传毒接种试验,传毒时间为15 d。结果发现:接种的辣椒、酸浆等茄科植物表现褪绿、黄化和皱缩等症状,而黄瓜、菜豆等非茄科植物未表现明显症状。利用RT-PCR技术检测接种植物中云南烟草丛顶病病原物的种类,发现酸浆、假酸浆、曼陀罗、番茄、矮牵牛和辣椒6种茄科作物均能感染云南烟草丛顶病中的4种病原物,而黄瓜、西葫芦、昆诺藜、豇豆、菜豆和油菜等6种植物只能感染云南烟草丛顶病中的部分病原物。其中,烟草扭脉病毒(TVDV)的检出率最高,为83.3%,表明TVDV在病害的发生及流行中起了重要作用,通过蚜虫传毒方式可以将云南烟草丛顶病中的部分病原物分开,有利于研究不同病原物在症状的形成及流行中的作用,同时为其他多种病毒复合侵染引起植物病害的研究提供参考。

烟草丛顶病毒编码的沉默抑制子初步鉴定

烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)为幽影病毒属成员,能在烟草上造成严重危害。TBTV基因组编码4个ORF,其中ORF3和ORF4几乎完全重叠,可能在TBTV的致病性中发挥重要作用。分别将TBTV的ORF3和ORF4与载体pGR107连接,构建植物表达载体pGR107-ORF3,pGR107-ORF4。经农杆菌与含外源GFP基因的pGREEN208共浸润转GFP基因的本氏烟16c叶片,2～5 d后(days post-inoculation,dpi)在紫外灯下观察发现浸润区有明显绿色荧光,其中pGR107-ORF4在12 dpi后浸润区绿色荧光区域扩大,推断ORF4编码产物可能具有局部抑制本氏烟16c对外源GFP基因进行沉默的功能;而pGR107-ORF3浸润区绿色荧光逐渐恢复红色,GFP基因发生沉默,说明ORF3编码产物不具有抑制基因沉默的功能。进一步利用real-time PCR定量检测发现,pGR107-ORF4浸润15 dpi的本氏烟叶片中GFP RNA的含量要比仅接种pGR107的对照高,比未接种的本氏烟16c稍低。推断是因为ORF4编码蛋白抑制了植物对外源GFP RNA产生的沉默,使GFP得以在本氏烟内表达。由此进一步证实ORF4编码产物是TBTV的基因沉默抑制子。

烟草丛顶病穴TBTV雪传毒特性及寄主范围研究

通过烟草丛顶病中间寄主、烟蚜传毒特性及重要物理性状的试验,得出烟草丛顶病毒的寄主范围是茄科植物;烟蚜的最短传毒时间为2min,最短获毒时间为1h,蚜虫的传毒持久期在9d以上,无翅蚜、有翅蚜均可传毒,新生胎蚜不传毒;该病毒的稀释限点为10-3,致死温度为70℃;烟草丛顶病毒可以通过汁液摩擦传播,但蚜虫取食汁液摩擦发病株后,不会将病毒传给健株。

烟草丛顶病毒云南不同分离物全基因组序列测定与分析

【目的】探明烟草丛顶病毒(Tobacco bushy top virus,TBTV)云南不同分离物之间的遗传差异并完成系统进化分析。【方法】采用RT-PCR方法扩增获得云南不同地区10个TBTV分离物的全基因组序列。【结果】10个TBTV云南分离物的全基因组序列均为4 152 bp,基因组结构由4个开放阅读框(ORFs)构成,ORF2通过与ORF1发生-1位的移码(frameshift)表达融合蛋白,推测ORF1末端的GGAUUUU特征序列是确定ORF1与ORF2是否发生移码翻译的依据。各TBTV云南分离物全基因组序列的核苷酸序列同源性为84.9%~99.1%,其中来自德宏的分离物(TBTV-YDHo)变异最大。TBTV不同分离物间存在重组现象,且分离物之间亲缘关系与重组的发生有关,重组主要发生在变异较大的ORF1~ORF2区段。TBTV分离物的各区段中,ORF1和ORF1~ORF2变异最大,而ORF4和3'UTR较为保守。系统进化分析结果表明:TBTV作为幽影病毒属(Umbravirus)的成员之一,其与同属中的罂粟花叶病毒(Opium poppy mosaic virus,OPMV)亲缘关系最近,核苷酸序列同源性为61.1%~61.6%;与CMo V和CMo MV亲缘关系较远,同源性为54%~55.1%。除幽影病毒属外,TBTV与番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)其他属的病毒核苷酸序列同源性为25.1%~49.8%;Tombusviridae中Umbravirus与香石竹环斑病毒属(Dianthovirus)的RNA2亲缘关系最远,与其他病毒属成员的亲缘关系都相对较近。【结论】TBTV云南各分离物之间存在一定的分子变异,有的存在重组现象;TBTV与OPMV亲缘关系最近。

烟草脉扭病毒基因组部分序列的克隆和分析

烟草脉扭病毒(Tobacco vein distorting virus, TVDV)是引起烟草丛顶病的两种病毒之一。TVDV被归为黄症病毒科的暂定成员。应用黄症病毒科的通用引物和根据马铃薯卷叶病毒属成员核酸序列设计的简并引物,通过RT—PCR从烟草丛顶病烟株总RNA中扩增到了TVDV基因组的部分序列。序列分析获得了长度为1654 bp的序列,编码推测的TVDV复制酶基因的部分序列、外壳蛋白基因及运动蛋白基因的全部序列。根据这三个基因编码的氨基酸序列构建的分子进化树分析表明,TVDV为黄症病毒科的确定成员。根据其基因间隔区的长度特征和各ORF编码的氨基酸的分子进化分析,我们推测TVDV应当是马铃薯卷叶病毒属的一个新成员。这是TVDV的分子生物学特征的首次报道。

TBTV卫星RNA不同分离物的序列测定及系统进化分析

利用RT-PCR方法对烟草丛顶病毒(tobacco bushy top virus,TBTV)卫星RNA不同分离物进行扩增和克隆测序,同时运用DNAMAN,MEGA,ClustalX等生物软件对TBTV和其它幽影病毒的卫星RNA核苷酸序列进行同源性比较,构建了幽影病毒属成员卫星RNA的系统进化树。E结果显示:TBTV不同分离物卫星RNA的核苷酸同源性为79.2%～99.0%。它们与幽影病毒属其它成员卫星RNA的核苷酸同源性为32.5%～44.1%。通过构建幽影病毒属成员卫星RNA的系统进化树可以看出:TBTV的卫星RNA与GRV的卫星RNA亲缘关系最近,与CMoMV的亲缘关系最远。

幽影病毒引起的几种主要植物病害

幽影病毒的基因组不编码外壳蛋白,不形成通常的病毒粒体结构。这类病毒往往和黄症病毒复合侵染引起植物病害,蚜虫传播是病害在田间传播流行的主要方式。对幽影病毒引起的胡萝卜杂色矮缩病、花生丛簇病以及烟草丛顶病等几种主要病害的症状、发生与危害、病原物特性以及病害的控制等进行了综述。