猪等孢球虫顶膜抗原蛋白AMA1的生物信息学分析及原核表达

[目的]预测分析猪等孢球虫顶膜抗原蛋白AMA1的生物学特性、结构及功能,并构建AMA1基因的原核表达载体,表达、纯化AMA1蛋白。[方法]本研究从NCBI数据库中获得猪等孢球虫AMA1基因序列,使用相关生物信息学预测工具对AMA1基因编码的蛋白进行分析。构建原核表达载体pET23a-AMA1,并将其转入至大肠埃希菌表达菌株BL21 (DE3)中,对诱导时间、温度及IPTG浓度进行优化,确定最佳诱导表达条件。采用镍柱亲和层析法进行蛋白纯化,获得AMA1重组蛋白并进行SDS-PAGE和Western blot鉴定分析。[结果]生物信息学预测显示,AMA1蛋白由317个氨基酸组成,蛋白分子式为C1 512H2 310N394O490S14,是不稳定的亲水性蛋白;其二级结构α螺旋占17.74%,β折叠占30.65%,转角占30.65%,无规则卷曲占20.96%;属于无信号肽的跨膜蛋白,具有5个B细胞抗原表位。成功构建pET23a-AMA1重组表达质粒,经诱导表达条件优化后,确定最佳诱导表达条件为0.2 mmol/L IPTG浓度下于28℃诱导12 h,主要以可溶性蛋白形式存在,蛋白相对分子质量约为25 800,纯化蛋白质量浓度为0.25 mg/mL。[结论]阐明了猪等孢球虫AMA1蛋白的结构特征,通过原核诱导表达获得了重组蛋白,为建立猪等孢球虫病的免疫学诊断方法奠定了基础,并为后续疫苗的研发提供了新的候选基因。

人类白细胞抗原-DQA1、细胞色素P4503A5*3基因多态性与特发性膜性肾病遗传易感性关联性研究

目的:探讨分析人类白细胞抗原(HLA)-DQA1、细胞色素P450(CYP)3A5*3基因多态性与特发性膜性肾病(IMN)遗传易感性的关联性。方法:将IMN患者62例作为研究组,另将健康者62例作为对照组。采用聚合酶链反应(PCR)技术和基因测序技术检测入组患者的HLA-DQA1(rs2187668)、CYP3A5*3(rs776746)基因型,判断各基因型与IMN患者的关系。结果:研究组中HLA-DQA1 rs2187668基因型AA占比高于对照组(P<0.05),基因型GG、AG占比低于对照组(均P<0.05);研究组等位基因A占比高于对照组(P<0.05)。研究组与对照组CYP3A5*3 rs776746不同基因型占比及等位基因占比比较无统计学差异(均P>0.05)。HLA-DQA1 rs2187668AA基因型IMN患者24 h尿蛋白量和血肌酐水平显著高于AG和GG型,肾小球滤过率显著低于AG和GG型(均P<0.05)。结论:HLA-DQA1 rs2187668位点的基因多态性与IMN的发生有关,AA基因型和等位基因A可增加IMN易感性。

不同分子亚型子宫内膜癌组织中叶酸受体1、前列腺特异性膜抗原的表达

目的:探讨不同分子亚型子宫内膜癌组织中叶酸受体1(FOLR1)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)的表达及意义。方法:收集2018年3月至2022年2月郑州大学第一附属医院病理科诊断、且采用高通量测序技术进行分子分型的140例子宫内膜癌患者的临床资料。采用免疫组化染色方法检测140例子宫内膜癌、27例非典型增生及10例增生期子宫内膜组织中FOLR1、PSMA的表达情况。结果:FOLR1、PSMA在正常子宫内膜、非典型增生及癌组织中表达逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。FOLR1在子宫内膜癌4种分子亚型中的表达差异无统计学意义(P=0.203)。PSMA在肿瘤细胞及肿瘤特异性血管、新生血管中均表达,在无特定分子特征型(NSMP)中过表达,明显高于其他组(P<0.05);PSMA表达与癌组织学类型、FIGO分期、ER及PR表达显著相关(P<0.05);子宫内膜癌组织中FOLR1与PSMA表达呈正关联(r S=0.170,P=0.045)。结论:FOLR1、PSMA可促进子宫内膜癌进展,且在子宫内膜癌恶性转化中相互协同。

MUM-1、CD138、CD38对慢性子宫内膜炎的诊断价值及其与生殖预后的关系

目的分析多发性骨髓瘤癌基因-1(MUM-1)、白细胞分化抗原(CD)138、CD38在对慢性子宫内膜炎(CE)中的诊断价值及其与生殖预后的关系。方法选取2018年1月至2021年12月因不孕症于山东省济南市第二妇幼保健院生殖健康科就诊,并在山东大学齐鲁医院生殖医学中心接受体外受精-胚胎移植(IVF-ET)的194例患者作为研究对象。所有研究对象术前均接受宫腔镜检查,记录宫腔情况,取子宫内膜组织进行MUM-1、CD138、CD38标志物免疫组织化学染色及子宫内膜活检,并将子宫内膜苏木精-伊红染色法(HE)染色结果作为金标准,免疫组织化学染色结果与HE染色结果的一致性分析使用Kappa检验,分析免疫组织化学染色MUM-1、CD138、CD38单独及3项指标联合检测对CE的诊断效能。根据生殖预后将194例患者分为失败组和成功组,比较失败组和成功组的临床资料,采用多因素Logistic回归分析IVF-ET失败的危险因素。结果HE染色结果显示,194例接受IVF-ET的患者中90例确诊为CE;MUM-1、CD138、CD38单独及3项指标联合检测的免疫组织化学结果与HE染色结果的一致性分析显示,Kappa值分别为0.475、0.537、0.464、0.752(P<0.05);3项指标联合诊断CE的灵敏度、准确度、阳性预测值均高于MUM-1、CD138、CD38单独诊断,差异均有统计学意义(P<0.05);CD38单独诊断CE的灵敏度高于MUM-1、CD138单独诊断,特异度低于MUM-1、CD138单独诊断,差异均有统计学意义(P<0.05)。194例接受IVF-ET的患者中妊娠失败106例,妊娠成功88例。失败组与成功组年龄、体质量指数、不孕年限、月经经期、月经周期,以及基础内膜厚度、基础促卵泡刺激素、基础雌二醇、基础促黄体生成激素水平比较,差异均无统计学意义(P>0.05);失败组继发性不孕、人工流产次数≥1次、CE、MUM-1阳性、CD138阳性、CD38阳性患者比例均高于成功组,差异均有统计学意义(P<0.05)。多因素Logistic回归分析结果显示,继发性不孕、人工流产次数≥1次、患有CE、MUM-1阳性、CD138阳性、CD38阳性是IVF-ET失败的危险因素(P<0.05)。结论MUM-1、CD138、CD38联合检测可提升对CE的诊断效能,且患有CE、MUM-1阳性、CD138阳性、CD38阳性是IVF-ET失败的危险因素。

细胞因子表达质粒对恶性疟原虫顶端膜抗原1DNA免疫的调节作用

目的 探讨细胞因子表达质粒对小鼠DNA免疫的促进和调节作用。 方法 构建编码恶性疟原虫顶端膜抗原 1(AMA1)完整胞外域的DNA免疫质粒VR10 2 0 /E ,构建编码小鼠细胞因子 (GM CSF)、白细胞介素 (IL)如IL 4和IL 12的真核表达质粒pcDNA3 /GM CSF、pcDNA3 .1( ) /IL 4和pIL 12以及双顺反子质粒pGM CSF/pTPA E ,分组免疫小鼠 ,ELISA检测血清中特异性IgG及其亚类的水平 ,取小鼠脾细胞进行体外增殖。 结果 3种细胞因子质粒均有效增强了小鼠针对VR10 2 0 /E的免疫应答 ,抗体水平增加 7至 10倍 ,其中pcDNA3 /GM CSF质粒和pIL 12质粒分别显著促进了小鼠的IgG1和IgG2a应答 ,小鼠脾细胞的体外增殖水平亦有明显提高。 结论 利用编码GM CSF、IL 4和IL 12的表达质粒作为佐剂可有效增强小鼠针对AMA1DNA的免疫应答 ,并对免疫应答的类型产生调节作用。

恶性疟原虫顶端膜抗原-1(P.f AMA1)基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化

本文采用PCR方法自P .f基因组中扩增了编码AMA 1完整胞外域及其相应结构域的基因片段 ,定向克隆入原核表达载体pET 16b和pET 30a (+) ,经测序确证后将重组子转入BL2 1(DE3)进行诱导表达 ,用SDS PAGE鉴定 ,对可溶性和包涵体形式的重组蛋白分别采用天然状态和变性状态下的Ni离子亲和层析进行纯化 ,变性蛋白再在GSH GSSG氧化还原条件下经透析重新折叠复性。所得纯化产物为进行有关AMA

恶性疟原虫顶端膜抗原1基因转染伯氏疟原虫模型的建立

目的建立恶性疟原虫顶端膜抗原1(AMA-1)基因转染伯氏疟原虫的模型.方法将含有恶性疟原虫AMA-1基因的重组转染质粒pDB.DTm.DB./AB.AF.DB.用BglI酶切线性化.伯氏疟原虫经体外培养和分离后进行电转化,转化的原虫经药物筛选后进行PCR检测.结果PCR检测显示转染伯氏疟原虫存在恶性疟原虫AMA-1基因.结论成功建立了恶性疟原虫AMA-1基因转染伯氏疟原虫的模型,为进一步研究提供了基础.

恶性疟原虫顶端膜抗原1基因多态性分析

目的研究不同地理分离株恶性疟原虫裂殖子顶端膜抗原1(Pf AMA-1)基因的多态性。方法采集2006-2012年福建省23例输入性恶性疟患者的血样,以血样中的疟原虫DNA为模板,巢式PCR扩增AMA-1基因片段,利用生物软件进行序列比对分析。结果 23份血样均扩增出目的条带(约505 bp),发现32个多态位点,共计18个单倍型,其中8个为新报道序列。来自非洲的恶性疟原虫分离株的AMA-1基因序列具有较丰富的遗传多样性[单倍型多样度(Hd)=0.985,核苷酸多样度(π)=0.0258],亚洲(东南亚和中国云南)的遗传多样性相对较低(Hd=0.909,π=0.0221)。多样化选择分析结果显示,非同义突变率与同义突变率差值(d N-d S)为0.031±0.006,中性检验结果均无统计学意义(P>0.05)。基因内重组分析显示,重组事件的最低数量(Rm)为10,连锁不平衡指数R2随核苷酸遗传距离增加呈明显下降趋势。采用邻接法构建的分子系统树显示,所有分离株分为3个群(G1,G2和G3),G1多为非洲分离株,G3大部分为亚洲分离株。结论来自非洲的恶性疟原虫分离株的AMA-1基因序列具有较丰富的遗传多样性。

伯氏疟原虫顶端膜抗原1胞外区及其亚区的表达与免疫保护作用分析

目的表达伯氏疟原虫顶端膜抗原1(PbAMA-1)胞外区E及其各亚区,分析其免疫原性和免疫保护作用。方法抽提伯氏疟原虫基因组,对PbAMA-1基因测序,依据该序列采用毕赤酵母密码子使用频率重新设计PbA-MA-1基因序列。将其胞外区E分为3个彼此重叠的基因片段DⅠ、DⅡ和DⅢ并进行优化,人工合成后在大肠埃希菌中诱导表达。表达产物经纯化和重折叠,分别与福氏佐剂乳化后免疫小鼠和家兔,均免疫3次,间隔2周。每次免疫剂量,小鼠为20$g,家兔为100$g。ELISA检测抗体效价,并以疟原虫攻击实验确定各抗原的免疫保护效果。结果测得的PbAMA-1基因序列与Sanger测序中心公布的序列完全一致。密码子优化并人工合成的DⅠ、DⅡ、DⅢ和E目的基因片段在大肠埃希菌表达载体pET32a均获得诱导表达,经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,各目的基因表达产物大小与预计的相对分子质量Mr 44 300、Mr 33 300、Mr 29 900和Mr 67 200相一致。表达产物经镍离子螯合柱(Ni-NTA柱)纯化和谷胱甘肽(GSH)氧化还原法体外重折叠,蛋白纯度达90%以上,各纯化的重组蛋白在小鼠体内均激发产生高滴度抗体。其中,完整的胞外区E第3次免疫后抗体滴度为(34.4±0.15)×10-4,与其他组相比,免疫原性较其他各亚区更强(t=5.66,P<0.01;t=2.27,P<0.05和t=5.05,P<0.01)。取家兔免疫血清与感染伯氏疟原虫ANKA株的小鼠血膜抗原片进行间接荧光抗体试验(IFAT),均为阳性,其中抗E的抗血清免疫荧光强度最高,与ELISA检测的抗体水平一致。取家兔抗血清对小鼠伯氏疟原虫粗提抗原进行蛋白质印迹(Western blot)分析,产生特异性反应条带,表明能够识别天然的PbAMA-1蛋白。免疫小鼠在以伯氏疟原虫攻击实验中得到部分保护,DⅠ、DⅡ、DⅢ和E各免疫组小鼠与佐剂对照组相比,存活时间明显延长(t=2.78,P<0.05;t=2.67,P<0.05;t=3.46,P<0.01和t=3.50,P<0.01)。结论人工合成的PbAMA-1具有良好的免疫原性和免疫保护作用,完整的胞外区E较其各亚区表现出更好的免疫原性。

STEAP1在膀胱移形细胞癌中的表达及其潜在诊断价值

目的探索前列腺六段扩膜上皮抗原1(STEAP1)在膀胱移行细胞癌中的表达及其潜在诊断价值。方法选取2021年6月至2022年12月于中国人民解放军联勤保障部队第九四O医院行外科手术治疗的52例膀胱移行细胞癌患者作为观察组,另外选取同期年龄、性别、基础疾病患病率等基础临床资料匹配的膀胱良性肿瘤患者52例作为对照组。通过酶联免疫吸附试验法、实时荧光定量聚合酶链反应测定两组患者膀胱肿瘤组织中STEAP1及STEAP1 mRNA相对表达水平,以及对比不同病理参数患者膀胱肿瘤组织中STEAP1及STEAP1 mRNA相对表达水平。通过Spearman相关性分析、二元Logistic回归分析筛选膀胱移行细胞癌发生及临床分期的危险因素,通过受试者工作特征(ROC)曲线及曲线下面积(AUC)评价各指标对膀胱移行细胞癌的诊断及预测价值。结果观察组膀胱肿瘤组织中STEAP1及STEAP1 mRNA相对表达水平均显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。中晚期膀胱移行细胞癌患者膀胱肿瘤组织中STEAP1及STEAP1 mRNA相对表达水平均显著高于早期膀胱移行细胞癌患者,差异有统计学意义(P<0.05)。通过二元Logistic回归分析表明,患者膀胱肿瘤组织中STEAP1及STEAP1 mRNA相对表达水平增高均是膀胱移行细胞癌发生及中晚期膀胱移行细胞癌的独立危险因素(P<0.05)。ROC曲线分析显示,患者膀胱肿瘤组织中STEAP1及STEAP1 mRNA独立预测膀胱移行细胞癌发生的AUC分别为0.841(95%CI:0.760~0.922,P<0.001)、0.936(95%CI:0.893~0.980,P<0.001),均具有较高的预测效能。结论膀胱移行细胞癌患者膀胱肿瘤组织中STEAP1及STEAP1 mRNA相对表达水平与膀胱移行细胞癌发生及中晚期膀胱移行细胞癌呈正相关,提示STEAP1可作为诊断、预测膀胱移行细胞癌发生、发展的潜在标志物。

柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1潜在子孢子互作蛋白的筛选

为了筛选与柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1(Eimeria tenella apical membrance antigen 1,EtAMA1)存在互作的子孢子蛋白,以柔嫩艾美耳球虫子孢子c DNA为模板,PCR扩增EtAMA1基因胞外区,将扩增产物与p GEX-6P-1连接,构建原核表达质粒p GEX-6P-1-EtAMA1,表达、纯化重组蛋白EtAMA1-GST。纯化的重组蛋白经Western blot验证,结果显示在75 k Da处有单一的目的条带,证实了所获得的蛋白为EtAMA1-GST融合蛋白。将EtAMA1-GST蛋白、GST蛋白和PBS分别与谷胱甘肽琼脂糖珠孵育后,再分别与子孢子裂解物共孵育,洗脱液经SDS-PAGE分析后,结果显示三者之间的条带明显不同。将差异条带切下进行质谱分析,对获得的蛋白质肽段与Uniprot中鸡球虫蛋白质数据库进行Blast比对,初步获得了10个与EtAMA1存在潜在互作的柔嫩艾美耳球虫子孢子蛋白,包括微线体蛋白、糖酵解酶类、肌动蛋白相关因子以及一些保守蛋白等,他们广泛参与了虫体的入侵、发育、能量代谢等生物学过程。研究结果为进一步阐明EtAMA1在球虫入侵宿主细胞中发挥重要作用的分子机制奠定了基础。

EB病毒膜抗原BLLF1基因在转基因小鼠中的表达

目的 :分析EB病毒膜抗原 (membraneantigen ,MA)BLLF1基因在转基因小鼠外周血淋巴细胞中的表达。方法 :EB病毒膜抗原BLLF1基因转基因首建鼠 4只 ,尾组织经PCR检测携带有BLLF1基因 ,用流式细胞仪分析MA在外周血淋巴细胞中的表达并用激光共焦显微镜确定MA在细胞中的表达部位。结果 :4只首建鼠中有 2只KM Tg EBV1和KM Tg EBV5外周血淋巴细胞中有MA的表达 ,表达部位在细胞浆中和细胞膜上。 结论

口蹄疫疫苗抗原加川芎嗪对体外培养大鼠心肌膜微血管内皮细胞分泌ET-1和NO的影响

为了弥补口蹄疫疫苗的免疫缺陷,为寻找新型低毒的口蹄疫疫苗中药佐剂提供试验依据,试验将体外培养的大鼠心肌膜微血管内皮细胞(MVECs)分为空白对照组(加入正常培养液)、口蹄疫疫苗组(加入混有口蹄疫疫苗稀释液的培养液)、口蹄疫疫苗+川芎嗪组(加入混有口蹄疫疫苗稀释液与川芎嗪溶液的培养液),分别测定口蹄疫疫苗与口蹄疫疫苗+川芎嗪对心肌膜MVECs分泌一氧化氮(NO)和血管内皮素1(ET-1)的影响。结果表明:口蹄疫疫苗组心肌膜MVECs分泌NO和ET-1的量较空白对照组极显著升高(P<0.01),但不是同比例升高,导致ET-1/NO的值偏离空白对照组接近2倍;而口蹄疫疫苗+川芎嗪组心肌膜MVECs分泌ET-1和NO的量较口蹄疫疫苗组显著或极显著降低(P<0.05或P<0.01),较空白对照组仍明显升高,但ET-1/NO的值比口蹄疫疫苗组降低,较接近空白对照组。说明中药川芎嗪保护了被口蹄疫疫苗损伤的心肌膜MVECs。

利用BgAMA-1抗原建立吉布森巴贝斯虫的ELISA诊断方法

本研究利用基因重组技术,构建并表达吉布森巴贝斯虫的重组顶膜抗原-1(BgAMA-1),将BgAMA-1作为诊断抗原,建立针对吉布森巴贝斯虫的ELISA诊断方法。结果显示,构建的重组表达质粒得以表达,建立的ELISA方法在血清学诊断中有较好的特异性。

吉布森巴贝虫顶膜抗原-1基因的表达及表达产物的生物学活性

通过免疫筛选法,从构建的犬吉布森巴贝虫cDNA基因表达文库中筛选到1个cDNA克隆,此cDNA核苷酸全长2 108 bp,包含1个完整的开放阅读框,编码蛋白的分子质量约为62 ku。经过分析,此蛋白(BgAMA-1)与其他巴贝虫属的顶膜抗原-1具有较高的同源性。为了研究其生物学活性,以此cDNA为模板,利用PCR扩增BgAMA-1的全基因,并将其克隆到pGEX-4T-3载体上,构建了原核表达载体pGEX-4T-3/BgAMA-1。通过Western-blotting对表达并纯化的重组蛋白的生物学活性进行分析。结果显示,构建的pGEX-4T-3/BgAMA-1能在大肠杆菌DH5α中表达,所获的重组抗原BgAMA-1在Western-blotting上仅与吉布森巴贝虫感染犬血清发生反应,证实其具有种特异性,在诊断方面可能有一定的应用价值。

Tim-3及其配体CEACAM1与特发性膜性肾病患者肾功能进展的相关性研究

目的探讨特发性膜性肾病(IMN)患者血清T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3(Tim-3)及其配体癌胚抗原相关细胞黏附分子1(CEACAM1)与其肾功能进展的相关性。方法选取2019年7月至2022年8月于该院住院并经肾组织活检确诊为IMN的80例患者作为IMN组,另选取77例同期体检健康者作为对照组。根据估算肾小球滤过率(eGFR)水平将IMN组分为肾功能正常组[eGFR>90 mL/(min·1.73 m^(2))],肾功能下降组[eGFR≤90 mL/(min·1.73 m^(2))]。采用酶联免疫吸附试验比较各组血清Tim-3、CEACAM1水平,分析IMN患者血清Tim-3、CEACAM1水平与一般临床指标的相关性,采用多因素Logistic回归分析影响IMN患者肾功能下降的危险因素。结果与对照组比较,IMN组血清Tim-3、CEACAM1水平升高(P<0.05);肾功能下降组血清Tim-3水平高于肾功能正常组(P<0.05);血清Tim-3水平与白蛋白、总蛋白、eGFR呈负相关(r=-0.266、-0.229、-0.374,P<0.05),与肌酐呈正相关(r=0.289,P<0.05);多因素Logistic回归分析结果显示,Tim-3水平升高是影响IMN患者肾功能下降的独立危险因素。结论IMN患者血清Tim-3、CEACAM1水平升高,Tim-3/CEACAM1可能在IMN的发生发展中发挥重要作用,血清Tim-3水平可为IMN患者治疗及预后提供一定依据。

黄曲霉毒素B1对鼠源树突状细胞生物力学特性、迁移能力和免疫功能的影响

目的黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是目前已知的最强化学致癌物之一,具有很强的免疫抑制作用,探究其对机体内功能最强大的抗原提呈细胞——树突状细胞(dendritic cells,DCs)生物力学特性(膜流动性、渗透脆性、黏附能力等)、DCs迁移能力和免疫功能的变化,为进一步解析AFB1引起的免疫毒性机制奠定基础。方法体外分离、诱导培养C57BL/6小鼠骨髓来源的DCs,在加入LPS诱导成熟过程中同时加入不同浓度的AFB1,分析DCs的膜流动性和渗透脆性的变化,检测DCs黏附能力及黏着斑的变化,并分析DCs的迁移能力、细胞骨架结构变化及刺激T细胞增殖分化的能力。结果AFB1处理后,DCs膜流动性增大、抗低渗环境的能力减弱;黏着斑数量明显增加,黏附分子的表达显著上调,细胞黏附能力增强;细胞迁移能力受到损伤,细胞骨架及其结合蛋白的表达水平发生不同程度的改变;DCs的免疫表型发生改变,刺激T细胞增殖的能力减弱,诱导初始T细胞向Th17细胞分化。结论AFB1能够显著影响DCs的分化成熟、生物力学特性和细胞骨架结构,进而调控其迁移能力和免疫学功能,这可能是AFB1发挥免疫抑制作用的机制之一。

利用BiFC技术研究柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原1结构域Ⅰ与棒状体颈部蛋白2互作关系

为了验证柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)顶膜抗原1结构域Ⅰ(apical membrance antigen 1 domain I,E tAMA1-DⅠ)与棒状体颈部蛋白2(rhoptry neck protein 2,EtRON2)的互作关系,以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增出492 bp的E tAMA1-DⅠ片段和1395 bp的E tRON2片段,并与pGEM-T-easy载体连接构建相应重组质粒。获得的阳性重组质粒及双分子荧光互补技术的真核表达载体pBiFC-VN155和pBiFC-VC155用E c oRⅠ和B g I II进行双酶切,将E tAMA1-DⅠ、E tRON2分别与pBiFC-VN155、pBiFC-VC155连接,构建真核重组质粒pBiFC-VN155-E tAMA1-DⅠ和pBiFC-VC155-E tRON2。将2个真核重组质粒分别转染BHK细胞进行表达,经间接免疫荧光鉴定,可在BHK细胞中成功表达。将2个真核重组质粒共转染至BHK细胞中,同时将pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(deltaZIP)VC155、pBiFC-bJunVN155和pBiFC-bFos(delta)VC155共转染至细胞中分别作为阳性和阴性对照组。BiFC结果发现真核重组质粒共转染组和阳性对照组的BHK细胞均产生绿色荧光,而阴性对照组无荧光,表明E tAMA1-DⅠ与E tRON2蛋白之间存在互作关系。本研究结果为深入研究E tAMA1及E tRON2在球虫入侵过程中的功能与作用机制奠定基础。

鸡柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原1(AMA1)的免疫保护效果评估

为评估顶膜抗原1(AMA1)对柔嫩艾美耳球虫感染的免疫保护效果,试验提取纯化了柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊总RNA,利用RT-PCR技术扩增柔嫩艾美耳球虫AMA1基因(EtAMA1)膜外区片段。将EtAMA1基因膜外区片段克隆入pVAX1.0中,获得真核表达重组质粒pVAX-EtAMA1。用柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊人工接种雏鸡,考察接种前后雏鸡体重变化、肠道病变记分及排出卵囊的减少量,评估重组质粒pVAX-EtAMA1对柔嫩艾美耳球虫感染的免疫保护效果。结果表明:EtAMA1基因膜外区片段为1 281 bp,编码427个氨基酸。用pVAX-EtAMA1免疫后,各试验组之间的平均增重1差异不显著(P>0.05),pVAX-EtAMA1质粒免疫试验组和非免疫感染对照组、非免疫非感染对照组之间平均增重2差异显著(P<0.05),且pVAX-EtAMA1质粒免疫试验组盲肠病变记分、克盲肠内容物卵囊数均低于3个对照组,pVAX-EtAMA1质粒免疫试验组、pVAX1.0空质粒免疫感染对照组、非免疫感染对照组、非免疫非感染对照组的抗球虫指数分别为176.90,134.55,106.81,200。pVAX-EtAMA1质粒免疫试验组鸡体重显著增加(P<0.05),盲肠损伤减轻,卵囊产量也明显下降。说明顶膜抗原1(AMA1)可对柔嫩艾美耳球虫感染提供一定的免疫保护力,并有望成为研制抵抗柔嫩艾美耳球虫野外感染疫苗的候选抗原。