Bcl-x微基因及其突变微基因的构建与鉴定

背景:Bcl-xL/Bcl-xS比值的增高与肿瘤的发生密切相关,其机制尚未阐明。Bcl-x微基因是研究其选择性剪接机制的重要工具。目的:构建人类凋亡相关基因Bcl-x的微基因及其突变微基因,为进行Bcl-x基因选择性剪接方面的研究打下基础。方法:首先采用PCR法从人白血病细胞K562基因组DNA中扩增出Bcl-x基因外显子2及内含子2的5’部分序列片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(-)中,然后扩增出Bcl-x基因内含子2的3’端及外显子3部分序列,定向插入上一片段下游,构建成pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因,测序鉴定无误后,用pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因瞬时转染HL-60,通过RT-PCR方法对其在细胞内表达作进一步鉴定。另外,以pcDNA3.1(-)-bcl-x微基因为模板,利用反向PCR法构建突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE1(M)。结果与结论:以人白血病细胞K562基因组DNA为模板,P1和P2为引物,经PCR扩增得约686bp的目的片段;以P3和P4为引物扩增出约178bp的目的片段。微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x分别经XbaⅠ和EcoRⅠ双切、XbaⅠ和XhoⅠ双切鉴定均得到预期的片段,突变微基因pcDNA3.1(-)-bcl-x-CRCE1(M)经EcoRⅠ单酶切后,均得到预期片段,测序结果正确,表明成功构建人类凋亡相关基因Bcl-x的微基因及其突变微基因。