二氢黄腐酚通过调控HK2表达对人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP的耐药性影响

目的 目前二氢黄腐酚通过调控HK2表达对人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP的耐药性影响及其机制研究较少。文中旨在研究黄腐酚衍生物二氢黄腐酚(DXN)对人卵巢癌顺铂耐药(DDP)细胞株SKOV3/DDP耐药影响和机制。方法 SKOV3/DDP细胞分成对照组、DXN组(4μmol/L DXN)、DDP组(4 mg/L DDP)、DXN+DDP组(4μmol/L DXN+4 mg/L DDP)、DXN+DDP+Vector组(转染空载质粒+4μmol/L DXN+4 mg/L DDP)、DXN+DDP+HK2组(转染HK2过表达载体+4μmol/L DXN+4 mg/L DDP)、si-NC组(转染siRNA control)、si-HK2组(转染HK siRNA)。MTT方法检测其增殖,计算IC50及其逆转倍数,Western blot检测HK2蛋白表达,测定葡萄糖摄取、乳酸产量。结果 DDP单独处理的IC50为16.17mg/L,联合DXN处理的IC50为9.72 mg/L,逆转倍数为1.66。与对照组和DDP组比较,DXN+DDP组的DDPSKOV3/DDP细胞HK2蛋白表达量、葡萄糖相对摄取量、乳酸相对生成量明显降低(P<0.05)。si-NC组、si-HK2组细胞与DDP处理后,IC50分别为17.92、11.17 mg/L,逆转倍数为1.60。与si-NC组比较,si-HK2组SKOV3/DDP细胞HK2蛋白表达量、葡萄糖相对摄取量、乳酸相对生成量明显降低(P<0.05)。与对照组和DXN+DDP+Vector组比较,DXN+DDP+HK2组SKOV3/DDP细胞中HK2蛋白表达量、葡萄糖相对摄取量、乳酸相对生成量明显升高(P<0.05)。计算DXN(0μmol/L)、DXN(4μmol/L)+Vector、DXN(4μmol/L)+HK2细胞与DDP处理后IC50分别为16.59、9.66、13.10 mg/L,DXN对SKOV3/DDP细胞DDP耐药的逆转倍数为1.72,过表达HK2和DXN联合处理对SKOV3/DDP细胞DDP耐药的逆转倍数为1.27。结论 DXN通过抑制HK2进而抑制有氧糖酵解逆转SKOV3/DDP耐药,为研究DXN在卵巢癌耐药中的作用机制奠定了基础。

β-榄香烯通过PI3K/Akt通路对人口腔鳞癌顺铂耐药细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨β-榄香烯(β-Ele)通过PI3K/Akt通路对人口腔鳞癌顺铂(DDP)耐药细胞的增殖、凋亡及耐药性的影响及机制。方法构建DDP耐药细胞株CAL-27/DDP,将细胞分为对照组、β-Ele组(40μg/mlβ-Ele)、DDP组(2 mg/L DDP)、β-Ele+DDP组(40μg/mlβ-Ele联合2 mg/L DDP)和β-Ele+DDP+PI3K激活剂740Y-P组(40μg/mlβ-Ele、2 mg/L DDP和50μg/ml 740Y-P)。采用MTT法检测其增殖活力,计算半数抑制浓度(IC_(50))。流式细胞术检测各组细胞的周期变化及凋亡情况。Western blotting检测PI3K/Akt通路相关蛋白的表达。结果CAL-27/DDP细胞对DDP的IC_(50)为5.53 mg/L,显著高于CAL-27细胞对DDP的IC_(50)(1.45 mg/L)。与对照组比较,β-Ele组和DDP组CAL-27/DDP细胞在72 h的增殖活力降低、凋亡率升高,而p-PI3K和p-Akt相对表达水平降低,其中β-Ele组细胞发生S期阻滞,而DDP组细胞发生G_(0)/G_(1)期阻滞(P<0.05)。与DDP组比较,β-Ele+DDP组细胞增殖活力进一步降低,细胞发生G_(0)/G_(1)期阻滞,凋亡率升高,p-PI3K和p-Akt相对表达水平降低(P<0.05)。与β-Ele+DDP组比较,β-Ele+DDP+740Y-P组的p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平升高,CAL-27/DDP细胞增殖率升高,细胞凋亡率降低(P<0.05)。结论β-Ele通过抑制PI3K/Akt信号通路的激活,抑制CAL-27/DDP细胞的增殖活力,促进其凋亡,从而降低其对DDP的耐药性。

川芎嗪基于KDM2B调控卵巢癌细胞顺铂耐药的机制

目的探索川芎嗪调控卵巢癌细胞顺铂耐药的潜在机制。方法用顺铂(cisplatin,DDP)诱导A2780细胞成为A2780顺铂耐药细胞株(A2780/DDP);将其分为对照组、阴性对照组、干扰组和川芎嗪组。干扰组和阴性对照组分别用si-KDM2B和si-NC进行转染。川芎嗪组给予终浓度为5 nmol·L^(−1)的川芎嗪(培养基溶解)处理细胞,对照组给予相同体积的培养基。每组细胞培养48 h后,收集耐药细胞。实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)用于检测mRNA表达水平,噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)用于细胞增殖实验,流式细胞术用于检测细胞凋亡,Western blotting用于检测细胞凋亡相关蛋白[(B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,BCl-2)、B淋巴细胞瘤-2相关蛋白X(BCL2-associated X protein,Bax)和半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)]的表达水平。结果赖氨酸特异性去甲基化酶2B(lysine-specific demethylase2B,KDM2B)在A2780/DDP中高表达,A2780/DDP细胞经川芎嗪或者KDM2B敲减处理后可以抑制A2780/DDP细胞增殖、促进细胞凋亡、上调凋亡相关蛋白(Bax和caspase-3)和下调BCl-2的表达水平。结论川芎嗪可能通过调控KDM2B抑制A2780/DDP细胞增殖和促进细胞凋亡。

补中益气汤对人胃癌顺铂耐药细胞株奥沙利铂化疗敏感性的作用及机制

目的:观察补中益气汤对人胃癌顺铂耐药细胞株SGC-7901CDDP奥沙利铂化疗敏感性的增强作用及机制。方法:将30株SGC-7901CDDP细胞株随机分为空白对照组、奥沙利铂组和补中益气组,每组10株,均置于DMEM高糖培养液中培养。空白对照组不添加其他药液培养,奥沙利铂组添加奥沙利铂注射液1 mL模拟化疗环境,补中益气组添加奥沙利铂注射液1 mL+补中益气汤3 mL进行培养。培养48 h后进行细胞化疗敏感性指标(细胞凋亡率、细胞迁移率、细胞周期、细胞生物学参数及化疗增敏比)及反应机制相关因子(survivin、Bcl-2、NF-κB)检测。结果:与空白对照组比较,奥沙利铂组和补中益气组的细胞凋亡率均较高(P<0.05),且补中益气组的细胞凋亡率明显高于奥沙利铂组(P<0.05)。在24 h和48 h两个时点,奥沙利铂组和补中益气组的划痕面积明显低于空白对照组(P<0.05),且补中益气组的划痕面积更小(P<0.05)。与空白对照组比较,奥沙利铂组和补中益气组细胞处于G2/M期的DNA占比明显下调,处于G1、S期的DNA占比明显上升(P<0.05);与奥沙利铂组比较,补中益气组细胞G2/M期DNA占比明显较低,处于G1、S期的DNA占比明显较高(P<0.05)。与空白对照组比较,奥沙利铂组和补中益气组的细胞化疗生物学参数(D_(0)、D_(q)、N)均显著下降,而化疗增敏值显著上升(P<0.05);与奥沙利铂组比较,补中益气组的细胞化疗生物学参数(D_(0)、D_(q)、N)均显著下降,而化疗增敏值显著上升(P<0.05)。与空白对照组比较,奥沙利铂组和补中益气组的survivin、Bcl-2、NF-κB表达均明显下调(P<0.05);与奥沙利铂组比较,补中益气组的survivin、Bcl-2、NF-κB表达均明显降低(P<0.05)。结论:补中益气汤能通过抑制细胞迁移、诱导细胞凋亡和提升人胃癌顺铂耐药细胞株的奥沙利铂化疗敏感性,其作用机制可能是补中益气汤通过下调survivin、Bcl-2、NF-κB细胞因子水平,从而提升化疗效果。

人端粒酶逆转录酶siRNA诱导宫颈鳞癌耐药细胞株SiHa/DDP凋亡的分子机制研究

目的研究人端粒酶逆转录酶siRNA(h TERT SiRNA)诱导宫颈鳞癌耐药细胞株Si Ha/DDP凋亡的可能机制。方法每毫升培养液中加顺铂2μg常规培养Si Ha/DDP细胞,实验分为4组,空白对照组(A组):仅用细胞培养液培养的Si Ha/DDP组;脂质体对照组(B组):仅添加转染试剂的Si Ha/DDP组;不针对任何基因的Negative Control siRNA对照组(C组);转染组(D组):h TERT SiRNA与脂质体混合液转染Si Ha/DDP细胞。按要求转染细胞后常规培养,于转染后24 h、48 h、72 h分别收集各组细胞进行相关检测,各组均应用实时荧光定量技术检测细胞h TERT mRNA表达、应用Annexin-V/PI双染流式细胞术检测Si Ha/DDP细胞凋亡率、应用MTT法检测h TERT SiRNA转染后Si Ha/DDP细胞增殖情况。结果 1转染后24 h、48 h、72 h各组细胞相对A组的TERT mRNA含量分别为:D组(0.249±0.019)、(0.138±0.009)、(0.174±0.016);C组(0.931±0.036)、(0.940±0.025)、(0.901±0.042);B组(0.956±0.052)、(0.961±0.037)、(0.943±0.28);各时间点siRNA-1组h TERT mRNA相对表达量与各对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。2转染后SiRNA-1组早期细胞凋亡率[(86.48±7.25)%]明显高于C组[(0.11±0.08)%]、B组[(5.23±1.22)%]和A组[(0.09±0.08)%],差异有统计学意义(P<0.05)。3转染后各时间点各组细胞OD490值比较差异有显著统计学意义(P<0.01),生长曲线显示SiRNA-1组慢于对照组。结论 h TERT siRNA转染Si Ha/DDP细胞可降低h TERT mRNA表达,抑制细胞增殖,促进细胞的凋亡。

长片段非编码RNA XIST可改变人鼻咽癌HNE1细胞对顺铂的耐药性

目的明确长片段非编码RNA(lncRNA)X失活特异性转录本(XIST)对人鼻咽癌细胞顺铂(DDP)耐药性的影响及可能的机制。方法通过荧光定量PCR检测人鼻咽癌顺铂耐药HNE1细胞株(HNE1/DDP)中XIST的表达特征。采用MTT试验观察XIST上调和下调对HNE1/DDP细胞DDP耐药性的影响,并通过EdU试验和流式细胞技术观察其对HNE1/DDP细胞增殖和凋亡的影响。采用蛋白质印迹法检测XIST上调和下调对促凋亡因子程序性细胞死亡4(PDCD4)和Fas配体(Fas-L)蛋白表达的影响。结果 XIST在HNE1/DDP细胞的表达量显著高于HNE1细胞(0.57±0.06 vs 0.1±0.02,P<0.05)。下调XIST的表达显著降低HNE1/DDP细胞对DDP的耐药性(P<0.05),而上调XIST增加对DDP的耐药性(P<0.05)。下调XIST的表达显著降低HNE1/DDP细胞增殖(6.17±1.93 vs 16.59 4.86, P<0.05)并诱导细胞凋亡[(18.04±4.72)%vs(4.22±1.65)%, P<0.05],而上调XIST增加细胞增殖(25.40±7.21 vs 13.16±3.95, P<0.05)并抑制细胞凋亡[(2.82±0.88)%vs(6.46±1.75)%, P<0.05]。下调XIST的表达显著增加HNE1/DDP细胞中PDCD4(4.10±0.42 vs 1.0±0.12, P<0.05和Fas-L(3.07 0.29 vs 1.0±0.14, P<0.05)蛋白的表达,而上调XIST降低PDCD4(0.36±0.11 vs 1.0±0.18, P<0.05)和Fas-L(0.17±0.09 vs 1.0±0.21, P<0.05)蛋白的表达。结论 XIST在HNE1/DDP细胞中表达升高,下调和上调XIST的表达可分别降低和增加HNE1/DDP细胞对DDP的耐药性,其机制可能与PDCD4和Fas-L蛋白表达改变相关。

PI-103对人卵巢癌细胞株SKOV3/DDP顺铂化疗效果的影响

目的:探讨磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)双抑制剂PI-103对卵巢癌耐顺铂株SKOV3/DDP顺铂化疗效果的影响。方法:将PI-103、顺铂及两者联合分别作用于SKOV3/DDP细胞,采用CCK-8法检测细胞生长情况,流式细胞技术检测药物单独或联合作用对细胞凋亡的影响;应用Western blot检测蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、核糖体蛋白(rpS6)、磷酸化rpS6(p-rpS6)以及凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax蛋白表达变化。结果:PI-103能够抑制SKOV3/DDP细胞增殖,且呈浓度、时间依赖性;联合用药可以明显增加对细胞生长抑制和凋亡作用。PI-103能下调Akt和rpS6的磷酸化水平,促DDP上调Bax和下调Bcl-2的表达。结论:PI-103抑制PI3K/Akt/mTOR信号传导通路,促DDP上调促凋亡蛋白及下调抗凋亡蛋白的表达,从而抑制癌细胞生长,诱导其凋亡,增加卵巢癌耐顺铂株SKOV3/DDP细胞对DDP的化疗效果。

木犀草素对卵巢癌顺铂和细胞凋亡相关蛋白的影响

目的观察木犀草素对卵巢癌细胞顺铂耐药细胞株的放射增敏作用及对其细胞因子的影响。方法 50份卵巢癌细胞顺铂耐药细胞株SKOV3随机分为阴性对照组、阳性对照组、1%木犀草组、2%木犀草组、4%木犀草组。阴性对照组正常培养。阳性对照组以6MV光子线性加速器10Gy强度在模拟放射环境下培养。1%木犀草组、2%木犀草组、4%木犀草组除模拟放射环境培养外,将1%、2%、4%木犀草素溶液1mL点滴于板孔中培养。观察各组的细胞形态学、放射增敏比、细胞凋亡因子等的变化情况。结果培养72h时,阴性对照组、阳性对照组、1%木犀草组、2%木犀草组、4%木犀草组的细胞放射生物学参数(D_(0)、D_(q)、N)比较,差异具有统计学意义(P<0.05),D_(0)、D_(q)、N均依次下降。培养72h时,阴性对照组、阳性对照组、1%木犀草组、2%木犀草组、4%木犀草组的survivin、Bcl-2、NF-κB表达均依次降低,组间两两比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论木犀草素对卵巢癌细胞顺铂耐药细胞株SKOV3具有放射增敏作用,其机制与木犀草素可改善SKOV3细胞促进凋亡相关基因表达降低有关。

补中益气汤含药血清逆转A549/DDP的顺铂耐药及对mTOR表达的影响

目的:研究补中益气汤含药血清对肺腺癌顺铂耐药细胞株(A549/DDP)顺铂耐药的逆转作用及对哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)表达的影响。方法:动物随机分组,制备补中益气汤高、中、低剂量血清(给药剂量分别为11.34,5.67,2.83 g.kg-1.d-1),将A549,A549/DDP细胞体外分为顺铂(DDP)组,空白血清+DDP组,含药血清高剂量+DDP组,含药血清中剂量+DDP组,含药血清低剂量+DDP组,细胞对照组,经过15%各组血清联合DDP不同浓度(10,20,40,80,100,200μmol.L-1)作用48 h,采用MTT法检测补中益气汤不同浓度含药血清对A549/DDP顺铂耐药的逆转作用;采用免疫荧光,免疫细胞化学,Western-blot方法检测mTOR的表达。结果:与DDP组比较,补中益气汤不同浓度含药血清作用于A549/DDP后IC50和耐药倍数均有显著降低(P<0.05),以补中益气汤中剂量组(等临床剂量组)作用最为显著(P<0.01),A549/DDP中mTOR的染色吸光度及荧光强度均明显减弱(P<0.01),蛋白表达水平明显降低(P<0.01)。结论:补中益气汤能增强A549/DDP对顺铂的敏感性,并能通过降低细胞生存通路中mTOR的表达而有效逆转肺腺癌细胞的顺铂耐药。

十全大补汤含药血清对A549/DDP细胞株中Wnt/β-catenin信号通路蛋白的干预作用

目的:探讨十全大补汤对肺腺癌顺铂耐药细胞株(A549/DDP)中Wnt/β-catenin信号通路蛋白的干预作用。方法:以SD大鼠制备高、中、低剂量(65,32.5,16.25 g·kg-1,10 m L·kg-1)的十全大补汤含药血清和空白对照血清(生理盐水10 m L·kg-1)。培养细胞分为十全大补汤含药血清高、中、低剂量组和空白血清组,采用MTT法检测各组50%抑制浓度(IC50),采用蛋白质印迹法检测各组糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β),p-GSK-3βser9,β-连环蛋白(β-catenin)及survivin蛋白表达。结果:随着十全大补汤含药血清浓度的升高,顺铂(DDP)对A549/DDP细胞的IC50逐渐降低,以中、高剂量组最显著(P<0.01);十全大补汤含药血清对A549/DDP细胞浆GSK-3β蛋白的表达无影响,但可显著下调胞浆p-GSK-3βser9蛋白的表达及细胞总β-catenin和survivin蛋白的表达,以中、高剂量组最明显(P<0.01)。结论:十全大补汤可通过降低A549/DDP细胞浆p-GSK-3βser9蛋白及细胞总β-catenin,survivin蛋白的表达而影响Wnt/β-catenin信号转导通路,进而发挥对顺铂耐药的增敏作用。