槐耳清膏和TOR逆转人肺腺癌细胞顺铂耐药性实验研究

目的:研究槐耳清膏体外逆转人肺腺癌细胞株A2/c DDP耐药性的作用,并与TOR比较,探讨其可能机制。方法:MTT法确定槐耳清膏最适逆转浓度和处理前后A2/c DDP细胞对顺铂的敏感性,并与托瑞米芬(TOR)比较;RT-PCR测定CTR1和GSTπ基因表达变化。结果:槐耳清膏最适逆转浓度为0.6 mg/m L,此时A2和A2/c DDP细胞抑制率均<5%;槐耳清膏和TOR的半数抑制率(IC50)分别为(4.21±0.005)mg/m L和(39.06±0.0115)μmol/m L,逆转倍数(RI)分别为2.95±0.023和3.15±0.014,均能明显逆转A2/c DDP耐药性,P<0.05;而两者间比较无明显差异,P>0.05;槐耳清膏能明显增高A2/c DDP细胞CTR1表达并抑制GSTπ的表达。结论:槐耳清膏能体外逆转A2/c DDP对顺铂的耐药性,其逆转能力与TOR相近;上调CTR1和下调GSTπ表达可能是其相关机制。

黄芪多糖降低A549/DDP肺腺癌细胞顺铂耐药机制研究

目的:研究黄芪多糖对A549/DDP肺腺癌细胞顺铂耐药的影响及可能机制。方法:将A549/DDP顺铂耐药肺腺癌细胞分为CON组(未行黄芪多糖及顺铂处理)、APS组(仅用黄芪多糖处理)、DDP组(仅用顺铂处理)及A+D组(黄芪多糖联合顺铂处理),比较四组细胞增殖、细胞周期及凋亡率和耐药基因表达的差异。结果:A+D组细胞d 1-d 7吸光度、S期、G 2/M期和PI均显著低于CON组、APS组和DDP组细胞(均P<0.05),G 0/G 1期和凋亡率均显著高于CON组、APS组和DDP组细胞(均P<0.05);APS组和A+D组细胞MDR1和MRP基因mRNA表达无明显差异(均P>0.05),且均显著低于CON组和DDP组(均P<0.05)。结论:黄芪多糖可显著改善A549/DDP肺腺癌细胞对顺铂耐药性,可能与黄芪多糖显著降低MDR1和MRP有关。

肺腺癌细胞株在不同浓度化疗药物连续刺激下erbB-2与c-myc基因的动态变化

目的:观察肺腺癌细胞株在连续化疗过程中erbB-2与c-myc基因的动态变化。方法:人肺癌细胞株经阿霉素、足叶乙甙、顺铂单药及联合用药连续刺激,每种药物分高、低个剂量梯度组,同时设对照组。记录细胞每次刺2激间隔的时间。应用流式细胞术分别检测erbB-2,c-myc的阳性细胞数及平均荧光强度,以此推算出不同药物在不同浓度下连续两三次作用细胞株后以上各蛋白表达的细胞数、平均表达量、总表达量。结果:随着培养时间的延长各项检测指标其阳性细胞的百分数、平均荧光强度及总荧光强度均呈下降趋势。erbB-2在高剂量各组基本上均随刺激次数的增加呈下降趋势,总表达量由94.8～1708.3下降到5.3～81.3;而低剂量的顺铂单药及联合用药组则上升。c-myc则无一定规律。结论:第次化疗后,erbB-2表达增高,随化疗次数增加表达大幅度下1降;化疗剂量大小与c-myc的表达无关。

人肺腺癌细胞A549耐药细胞系的建立及意义

目的建立人肺腺癌细胞A549耐药细胞系,为药物逆转细胞耐药提供实验基础。方法培养人肺腺癌细胞A549,用不同浓度顺铂(cDDP)反复冲击,建立稳定表达耐药基因的耐药细胞。结果经过10次、12次反复冲击后,A549细胞对具有较强的耐受力,IC50分别达到65.65μmol/L和81.58μmol/L,而对照组分别为24.33μmol/L和19.61μmol/L,耐药细胞内有耐药基因(MDR)的表达。结论用不同浓度cDDP反复冲击肺腺癌细胞A549,可以建立高表达耐药基因及高耐药指数的耐药细胞。

人参单体Rh2对肺腺癌耐药细胞促凋亡作用的研究

目的探讨人参单体Rh2对肺腺癌耐药A5 49DDP细胞的促凋亡作用。方法用MTT法分别检测顺铂和Rh2对A5 49细胞、A5 49DDP细胞的抑制率(IC)。将Rh2作用于A5 49DDP细胞,Hoechst3 3 2 5 8染色荧光显微镜下观察细胞核形态,流式细胞仪检测细胞跨膜电位(Δψ)。结果顺铂对A5 49细胞、A5 49DDP细胞的IC50 分别为2 4 μmol/L、32 5 μmol/L ,耐药指数为13.5 4。Rh2 >10 μmol/L时,对A5 4 9DDP细胞有明显抑制作用,且与Rh2的浓度有一定的依赖关系。Rh2作用后A5 4 9DDP细胞核缩小或变形,荧光成团块分布,有凋亡小体形成;细胞线粒体跨膜电位显著性降低(P <0 .0 1)。结论Rh2能促使A5 4 9DDP细胞凋亡,其可能是通过降低细胞的线粒体跨膜电位来诱导细胞凋亡。

GANT61阻断Hedgehog信号通道调控肺腺癌A549/DDP细胞耐药的机制研究

目的:探讨GANT61阻断Hedgehog信号通道调控肺腺癌A549/DDP细胞增殖、细胞周期及耐药的机制研究。方法:应用CCK8法检测顺铂(DDP)对肺腺癌细胞株A549和A549/DDP的半数抑制浓度(IC50),从而计算A549/DDP细胞的耐药指数;同时采用Western blot检测A549、A549/DDP细胞中Gli1、Ptch1、Shh、XRCC1蛋白的表达水平。用不同浓度的GANT61干预A549/DDP细胞后,CCK8法检测增殖活力。流式细胞术检测GANT61对A549/DDP细胞凋亡率和细胞周期的影响。Western blot检测GANT61对A549/DDP细胞周期和凋亡相关蛋白表达的影响。采用20μmol/L GANT61联合不同浓度的顺铂干预A549/DDP细胞,CCK8法检测各组细胞增殖抑制率变化及Western blot检测各组细胞中XRCC1蛋白的表达水平。结果:A549/DDP细胞的耐药指数为5. 34。A549/DDP细胞与A549细胞相比,Gli1、Ptch1、Shh、XRCC1在蛋白表达水平明显升高,差异有统计学意义(P <0. 01或P <0. 05)。使用GANT61处理A549/DDP细胞,当其浓度分别≥20μmol/L、≥10μmol/L时,分别培养24 h和72 h,与对照组相比肿瘤细胞增殖活性下降(P<0. 01),且呈现剂量依赖性。GANT61可通过下调c-myc、cyclin D1表达(P<0. 01),阻滞细胞周期于G1期(P<0. 01)。GANT61能够明显诱导A549/DDP细胞发生凋亡(P<0. 05),其分子机制可能与促进caspase-3的剪切活化相关(P<0. 05)。GANT61联合顺铂用药后使A549/DDP细胞抑制率显著增加,呈协同效应,且伴随XRCC1蛋白表达下降(P<0. 01)。结论:Gli1在人肺腺癌耐药细胞A549/DDP中的表达明显高于顺铂敏感株A549,提示Gli1可能与肺腺癌顺铂耐药相关,且XRCC1蛋白在A549/DDP细胞高表达。故采用Gli1抑制剂GANT61能够明显抑制A549/DDP细胞增殖,阻滞细胞周期,并诱导细胞凋亡。体外试验中,GANT61与顺铂联合用药可以协同抑制增殖作用,其机制可能与下调XRCC1蛋白表达有关。

补中益气汤含药血清联合顺铂对人肺腺癌A549/DDP细胞Nrf2、PRX1、SOD、GPX4的影响

目的探讨补中益气汤含药血清联合顺铂对人肺腺癌A549/DDP细胞中核因子红系2相关因子2(Nrf2)及其下游抗氧化蛋白的影响。方法将60只大鼠按随机数字表法分为空白组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,每组15只。低、中、高剂量组分别灌胃3.29、6.57、13.13 g/kg补中益气汤,1次/d,持续7 d。末次给药后1 h,腹主动脉取血,制备补中益气汤含药血清。将A549/DDP细胞按随机数字表法分为空白组(空白组大鼠血清)、模型组(空白组大鼠血清+顺铂)、低剂量组(低剂量含药血清+顺铂)、中剂量组(中剂量含药血清+顺铂)、高剂量组(高剂量含药血清+顺铂),相应药物干预24 h后,采用CCK-8法检测各组A549/DDP细胞对顺铂的半数抑制浓度(IC50);共聚焦荧光定位法检测p-Nrf2荧光表达强度;RT-qPCR法检测Nrf2 mRNA水平;Western blot法检测各组A549/DDP细胞中Nrf2、p-Nrf2、过氧化物还原酶1(PRX1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、SOD蛋白相对表达。结果与模型组比较,低、中、高剂量组A549/DDP细胞对顺铂的IC50降低(P<0.01);p-Nrf2荧光强度降低(P<0.01);Nrf2 mRNA水平降低(P<0.01);Nrf2、p-Nrf2、SOD、PRX1、GPX4蛋白表达下调(P<0.01),尤以中、高剂量组效果更显著(P<0.05)。结论补中益气汤含药血清通过抑制A549/DDP细胞中Nrf2活性表达及下调其靶基因SOD、PRX1、GPX4蛋白表达,改善肺腺癌顺铂耐药。

IGF2BP1表达水平对肺腺癌顺铂耐药性影响的研究

作者先前的研究揭示胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白(IGF2BP1)在肺腺癌(LUAD)中高表达预示不良预后并影响免疫微环境,为了探讨其对LUAD顺铂耐药的影响,利用CTR-DB数据库揭示了IGF2BP1在肺癌和间皮瘤等肿瘤中与卡铂联合紫杉醇、顺铂联合培美曲塞等药物抵抗相关;TCGA-LUAD转录组数据挖掘显示顺铂耐药组对奥沙利铂也呈现显著耐药。结果显示IGF2BP1表达与顺铂和奥沙利铂敏感性显著负相关,顺铂耐药组和敏感组的差异基因对甘油三酯代谢、氨基酸跨膜运输、加单氧酶活性和脂肪酸反应等生物功能有显著影响。IGF2BP1与46个顺铂耐药差异表达基因显著共表达,预后分析揭示他们中有32个基因影响LUAD患者总体生存率,且28个基因是预后不良因素。体外实验表明敲除IGF2BP1的LUAD细胞对顺铂敏感性上升,进一步抑制肿瘤细胞生长和克隆形成。综上所述,LUAD IGF2BP1表达水平与患者顺铂敏感性显著相关,IGF2BP1共表达基因显著影响患者预后,通过敲除IGF2BP1能显著提高LUAD细胞对顺铂的敏感性,本项研究可能会为LUAD的耐药带来一个新的研究方向。

靶向阻断LRP提高肺腺癌细胞对紫杉醇的敏感性

目的利用小干扰RNA(siRNA)技术沉默肺腺癌细胞肺耐药相关蛋白基因(LRP),探讨其对肺腺癌紫杉醇耐药株(A549/TXL20)紫杉醇(TXL)敏感性的影响。方法逐步增加药物浓度法建立A549紫杉醇耐药细胞株(A549/TXL20),用小干扰RNA技术沉默LRP在A549/TXL20细胞中的表达,以MTT法检测紫杉醇对A549/TXL20细胞的半数抑制浓度(IC50);以q PCR检测细胞中LRP mRNA的表达,Western blot检测细胞中LRP蛋白的水平,裸鼠腋窝皮下注射转染后的A549/TXL20细胞,建立裸鼠移植瘤模型,观察LRP靶向siRNA对人肺腺癌耐药细胞株A549/TXL20移植瘤耐药的影响。结果肺腺癌紫杉醇耐药株(A549/TXL20)对紫杉醇的敏感性明显增强(P<0.01),A549/TXL20细胞中LRP mRNA及蛋白表达显著增加(P<0.01);siRNA沉默A549/TXL20细胞LRP基因后,与空白组和空质粒组比较,LRP mRNA及蛋白表达均被抑制(P<0.01);小干扰RNA可提高荷瘤裸鼠对紫杉醇的敏感性。结论 siRNA可有效沉默A549/TXL20肺腺癌耐药细胞株LRP基因的表达,提高耐药的肺腺癌细胞对紫杉醇的敏感性。

人肺腺癌A549及A549/DDP细胞株差异蛋白质组学分析

目的比较人肺腺癌细胞株A549和耐顺铂株A549/DDP细胞的蛋白表达谱,筛选肺癌耐药相关蛋白,为阐明肿瘤细胞的耐药提供新线索。方法对两种细胞株进行比较蛋白质组学研究,利用双向凝胶电泳技术(2-DE)分离细胞总蛋白,经图像分析软件分析、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)鉴定差异蛋白质点,并用免疫细胞化学(ICC)对部分差异蛋白进行验证。结果获得分辨率高、重复性好的A549、A549/DDP总蛋白图谱,初步筛选出差异蛋白质点,经质谱分析及数据库检索,鉴定出13种差异表达蛋白质,这些蛋白与细胞代谢、结构、解毒和DAN修复、以及信号转导等相关。结论 A549、A549/DDP细胞株存在差异表达蛋白质点,提示这些蛋白可能与A549细胞耐顺铂相关,为研究肺癌耐药提供依据。

MND1通过与KLF6结合形成MND1-KLF6-E2F1正反馈环加速细胞周期进程促进肺腺癌进展

背景与目的在全球范围内,肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)在肺癌患者中所占比例不断升高,肺腺癌在癌症相关死亡中所占比例很高。本研究旨在筛选出新的癌基因,为肺腺癌治疗提供潜在靶点,探究肺腺癌发生发展的机制。方法我们通过分析基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)和癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)的数据,并进行转录组筛选和生存分析,获得了一个潜在的肺腺癌风险生物标志物——减数分裂核分裂1(meiotic nuclear divisions 1,MND1)。我们通过细胞活力检测和皮下异种移植瘤模型验证MND1在肺腺癌细胞增殖和肿瘤生长中的致癌作用。通过质谱、免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)和染色质免疫共沉淀(chromatin immunoprecipitation,ChIP)等实验探讨其潜在分子机制。结果通过组织芯片染色和第三方数据分析评估,MND1高表达是肺腺癌患者总生存期的独立风险因素。体内和体外试验结果表明,MND1通过加速细胞周期进程促进肺腺癌细胞增殖。Co-IP、ChIP和双荧光素酶报告基因实验结果显示,MND1竞争性地与肿瘤抑制基因KLF6(kruppel-like factor 6,KLF6)结合,从而保护E2F转录因子1(E2F transcription factor 1,E2F1)免受KLF6诱导的转录抑制。荧光素酶报告基因和ChIP分析发现,E2F1通过反馈方式与MND1启动子结合,进而激活MND1转录。结论在肺腺癌中,MND1、KLF6和E2F1形成正反馈环调控细胞周期,导致肺腺癌顺铂耐药。MND1对肿瘤恶性进展至关重要,可能是肺腺癌潜在的治疗靶点。

不同浓度顺铂对肺癌A549细胞凋亡相关蛋白Bcl-2与Bax表达的影响

通过观察不同浓度顺铂作用下肺腺癌A549细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达及表达比例的变化,探讨Bcl-2和Bax与铂类药物敏感性的关系。研究采用CCK8检测顺铂作用下A549细胞的半数抑制浓度IC50值,确定顺铂用药范围。实时定量PCR、Western blotting法检测不同浓度顺铂作用下肺腺癌A549细胞中抗凋亡因子Bcl-2、促凋亡因子Bax的mRNA及蛋白表达情况,以及两者表达比例的变化。结果随着顺铂浓度的不断升高,Bcl-2及Bax的表达均增加,而抗凋亡因子Bcl-2升高的趋势更为明显,Bcl-2/Bax表达比例增加。提示随着顺铂浓度的提高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达比例逐渐增加,可能会部分降低铂类促肿瘤细胞凋亡的作用,从而参与了铂类的耐药过程。

磁性纳米四氧化三铁协同顺铂作用于肺癌A549细胞的初步研究

目的:检测磁性纳米四氧化三铁(Nano-Fe3O4)联合顺铂(DDP)作用于人源肺腺癌细胞A549后相关凋亡抑制基因、耐药蛋白的表达,研究其增强化疗敏感度的机制。方法:用MTT法检测Nano-Fe3O4聚合DDP对A549细胞增殖凋亡的影响;流式细胞术分析凋亡细胞比例;RT-PCR检测抗凋亡基因bcl-2、survivin、ERCC1表达水平变化;蛋白印迹法分析耐药蛋白MRP及其表达率。结果:25μg.ml-1Nano-Fe3O4能有效增强DDP的细胞毒作用,提高A549的凋亡率;与单独用药组相比,Nano-Fe3O4联合DDP组的抗凋亡基因bcl-2、ERCC1和耐药蛋白MRP表达下调,差异具有统计学意义(P<0.05);survivin基因表达未见明显改变。结论:Nano-Fe3O4联合DDP可通过下调抗凋亡基因bcl-2、ERCC1及耐药蛋白MRP的表达,增强化疗药物敏感度。

膜脂物理状态的变化与肺腺癌细胞A_(549)的顺铂耐药性

用荧光探剂DPH分别标记药物敏感的肺腺癌细胞A549和抗顺铂药物的肺腺癌细胞A549/DDP, 对其膜脂物理状态的变化研究结果表明, 对顺铂药物敏感的A549的DPH各向异性值(P)为0.162, 而抗顺铂药物的A549/DDP者为0.194, 统计分析表明二者具有明显的差异. 当用可探测细胞膜脂双层不同层次的荧光探剂2-AS, 7-AS和12-AS进一步测定不同层次的膜脂质分子的流动性变化时, 结果表明: 分别反映膜表层和中层的2-AS和7-AS的各向异性值, 对敏感性的A549细胞分别为0.134和0.144, 具抗药性的A549/DDP细胞则分别为0.171和0.178. 而反映膜深层脂质分子变化的12-AS的各向异性值二者却无显著差异. 这提示, 两种细胞膜脂流动性的变化主要反映在膜的表层和中层. 同时, 用MC540荧光探剂标记两种细胞膜在FCM (flow cytometry)上测定反映膜脂质分子头部堆积程度差异的二维散点图及频数分布直方图的结果分析也表明, A549/DDP细胞膜脂质分子的有序性增加, 即流动性降低. 用气相色谱测量两株细胞膜脂肪酸的不饱和度, A549/DDP细胞膜脂肪酸的不饱和度明显低于A549细胞, 进一步肯定了上述结果. 结果提示, 在药物长期作用下, 膜脂物理状态的变化亦可能是肿瘤细胞具有抗药性的原因之一.

奥美拉唑逆转人肺腺癌耐顺铂细胞株A549/DDP耐药性的研究

目的:探讨液泡ATPase[vacuolar(H+)-ATPase,V-ATPase]非特异性抑制剂奥美拉唑(omeprazole,OME)逆转人肺腺癌耐药细胞株A549/DDP的耐药性及可能的作用机制。方法:以非细胞毒性浓度4μg/mL的OME预处理A549/DDP细胞24 h,再用2μg/mL顺铂(cisplatin,DDP)处理A549/DDP细胞。MTT法检测细胞的增殖抑制率,激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscope,LSCM)法间接检测细胞内pH值的变化,FCM法检测凋亡相关蛋白Bcl-2和PTEN的表达,RT-PCR法检测VATPase、Bcl-2和PTEN mRNA的表达。结果:OME具有逆转A549/DDP细胞耐药性的作用,逆转倍数为1.45(P<0.01);OME预处理后A549/DDP细胞内pH值明显降低,Bcl-2蛋白表达下降,PTEN蛋白表达增加(P<0.01)。V-ATPase在亲本A549及A549/DDP细胞中相对表达量分别为0.88±0.00和0.99±0.00(P<0.01);A549/DDP细胞中V-ATPase在有无OME预处理的情况下的相对表达量分别为1.09±0.00和1.05±0.02,差异无统计学意义。Bcl-2 mRNA相对表达量下降(P<0.01),PTEN mRNA相对表达量增加(P<0.01)。结论:V-ATPase在A549/DDP细胞中高表达,OME能部分逆转A549/DDP耐药性,其作用机制可能与上调PTEN和下调Bcl-2表达有关。