体外培养GFP裸小鼠颅骨细胞的表形分析

目的本研究建立的转绿色荧光蛋白基因近交系裸小鼠(GFP裸小鼠)已在示踪研究胶质瘤微环境方面起了重要作用,但在治疗自体颅骨成形术后骨吸收并发症的效果及机制方面未见报告,本文旨在分析体外培养GFP裸小鼠颅骨细胞的表形,为治疗颅骨吸收准备工具细胞奠定基础。方法取生后3 d的GFP裸小鼠,在无菌条件下解剖双侧顶骨,连同骨膜,将颅骨剪成1 mm2左右的小片,置于含有胎牛血清的1640培养基中,在5%CO2培养箱中作短期传代培养,收集从骨片上长出的细胞作相关检测。结果对原代(P0)和继代(P1、P2)细胞观察表明,在60 mm皿底长满90%的传代时间约6~8 d,抽样细胞计数约2.3×106~2.5×106个/皿,形态以纤维形为主,也有星形和树突状;在荧光显微镜下所有细胞全部发绿色荧光,形态与白光镜下一致;标志蛋白检测表明,在整个细胞群中同时存在BMP-6+的成骨祖细胞和CD206+、CD68+的巨噬细胞。结论基于颅骨再生,除了成骨祖细胞作为起始细胞,还必须有巨噬细胞参与维持环境稳态,培养成功的P0,P1和P2三代细胞因同时满足这个需要,有望作为工具细胞进一步用于颅骨再生的研究。

C反应蛋白激活原纤毛抑制颅骨成骨细胞的增殖和分化

目的研究C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)对原代培养SD大鼠乳鼠颅骨成骨细胞(rat calvarial osteoblasts,ROB)增殖及成骨分化的影响。方法取SD乳鼠颅骨组织用胰蛋白酶和胶原蛋白酶Ⅰ消化得到原代ROB,随后将ROB用α-MEM培养基培养,传代3次后用于后续实验。在对照组和5 mg/mL CRP的处理组中,成骨分化培养基诱导3 d进行免疫荧光检测两组Ki-67和acetylated-α-tubulin和γ-tubulin表达情况;同时,蛋白质印迹分析osteopontin(OPN)、alkaline phosphatase(ALP)、acetylated-α-tubulin和γ-tubulin的表达;成骨分化培养基诱导21 d茜素红染色检测成骨基质矿化结节量。结果免疫荧光显示,5 mg/mL CRP抑制成骨细胞增殖,与对照组差异有统计学意义(P<0.001);蛋白质免疫印迹和茜素红染色显示,处理组OPN和ALP表达降低(P<0.01),矿化结节生成数量减少(P<0.001),与对照组比较差异均有统计学意义;免疫荧光结果显示,细胞原纤毛长度增加(P<0.001),免疫印迹结果显示acetylated-α-tubulin和γ-tubulin蛋白的表达均升高(P<0.001)。结论5 mg/mL CRP显著抑制ROB增殖与成骨分化矿化并且显著激活细胞原纤毛。CRP为炎症因子典型代表,这些数据表明炎症因子激活细胞原纤毛发挥其抑制成骨细胞的增殖与分化作用,提示抑制原纤毛或阻断炎症因子的释放可以治疗炎症引起的骨丢失疾病。

颅骨巨细胞瘤的CT诊断

颅骨巨细胞瘤的ＣＴ诊断姜卫国①杨喜林周韬颅骨巨细胞瘤是一种罕见的骨肿瘤，我们近年来收集到７例，均经手术及病理证实，本文将探讨颅骨巨细胞瘤的ＣＴ特点及诊断。１材料与方法本组７例病人，男３例，女４例。年龄５～５４岁，平均３１岁。病程６个月～４０年，平均６...

间歇性高糖环境对小鼠颅骨成骨细胞的影响

目的:观察间歇性高糖环境对小鼠颅骨成骨细胞形态、增殖及功能蛋白表达的影响。方法:将体外培养原代小鼠颅骨成骨细胞分为3组:正常糖浓度组(5.5mmol/L GLU)、持续性高糖组(25mmol/L GLU)、间歇性高糖组(5.5mmol/L GLU^25mmol/L GLU),干预3天后,MTT法检测细胞增殖抑制率;干预3周后,比色法和放射免疫法(RIA)分别检测培养上清液中碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素(OCN)水平的变化。结果:(1)在相同干预时间点,与正常糖浓度组相比,高糖组细胞增殖受抑制,其中间歇性高糖组细胞受抑制更显著(P<0.05)。(2)在相同干预时间点,高糖组成骨细胞的ALP、OCN均较正常糖浓度组下降,其中间歇性高糖组下降更显著;(3)随干预时间增加,高糖组成骨细胞的ALP、OCN均较正常糖浓度组下降(P<0.05)。结论:高糖环境可抑制成骨细胞的增殖、诱发细胞凋亡,并导致功能蛋白ALP、OCN下降,且这一损害作用在间歇性高糖环境更为显著。

应用颅骨-破骨细胞联合培养体系研究先天性成骨不全破骨细胞骨吸收活性

目的先天性成骨不全(OI)的主要临床表现为骨矿化过程不良,骨量丢失,骨骼畸形和骨折。但是其发病机理,尤其在其骨再建过程中成骨细胞(OB)及破骨细胞(OC)的功能改变尚不清楚。本实验以先天性成骨不全小鼠模型,oim/oim为基础,应用破骨细胞-颅骨联合培养体系研究OB和OC两种细胞在骨再建过程中的功能改变和相互作用。方法本实验采用小鼠颅骨(CAL)组织培养模型。本模型采用颅骨组织培养,利用颅骨中成骨细胞可以从颅骨片游离出到培养皿及颅骨表面,从而支持培养皿及颅骨表面前体破骨细胞分化成为成熟破骨细胞,并吸收颅骨产生吸收陷窝。本实验中,共2组颅骨-破骨细胞联合培养体系:(1)对照组(WT)颅骨与对照破骨细胞(WTCAL-WTOC);(2)OI颅骨与OI破骨细胞(OICAL-OIOC)。联合培养颅骨及骨髓组织14日后,以TRAP免疫组化染色方法识别破骨细胞,ALP免疫组化染色方法识别成骨细胞,计算OC/OB。破骨细胞骨吸收活性以颅骨表面骨吸收陷窝占颅骨表面百分比并除以培养系统中的破骨细胞数表达。结果第14日,OICAL-OIOC组的破骨细胞数低于WTCAL-WTOC组(92.50+23.18/mm2对比379.00+136.53/mm2,P<0.01);OICAL-OIOC组的OC/OB明显低于WTCAL-WTOC组(0.68+0.57对比1.65+0.67,P<0.01);OICAL-OIOC组OI破骨细胞的吸收能力高于WTCAL-WTOC组(27.76+22.81对比7.32+5.09,P<0.001)。结论 oim/oim小鼠破骨细胞-颅骨培养体系中破骨细胞的数目明显减少,成骨细胞支持破骨细胞分化能力减低;但其破骨细胞骨吸收活性明显增强,以代偿成骨细胞功能,维持骨再建过程中成骨过程及骨吸收过程的平衡。

应用破骨细胞-颅骨联合培养体系研究先天性成骨不全的骨再建过程

目的采用先天性成骨不全(OI)小鼠,oim/oim为动物模型,应用破骨细胞-颅骨联合培养体系研究OB和OC两种细胞在OI骨再建过程中的功能改变和相互作用。方法实验采用小鼠颅骨(CAL)组织培养,实验设两组:WTCAL-WTOC组:联合培养对照组颅(WTCAL)与对照破骨细胞(WTOC);OICAL-OIOC组:联合培养OI颅骨(OICAL)与OI破骨细胞(OIOC)。以免疫组化染色方法-TRAP识别破骨细胞,ALP免疫组化染色方法识别成骨细胞。破骨细胞骨吸收活性为骨吸收陷窝占颅骨表面百分比。单位OC吸收面积为总骨吸收陷窝除以破骨细胞数。结果于7d,OICAL-OIOC组破骨细胞数低于WTCAL-WTOC组;OICAL-OIOC组的OC/OB比例低WTCAL-WTOC组;OICAL-OIOC组单位破骨细胞吸收能力高于WTCAL-WTOC组。结论 OI的小鼠模型骨再建中骨量丢失一方面由于其成骨细胞功能异常,另一方面也可能因为其破骨细胞的代偿性功能活跃。

胎兔颅骨成骨细胞克隆筛选及鉴定

目的：筛选胎兔颅骨细胞原代培养中的细胞克隆，建立成骨细胞株。方法：从服兔颅骨组织中分离培养颅骨细胞，在此基础上，运用有限稀释法进行克隆传代筛选，建立成骨细胞株，并运用酶组化、免疫级化及染色体染色等方法予以鉴定。结果：原代培养的颅骨细胞来源复杂，形态多样；克隆传代筛选的细胞株，细胞形态单一，碱性磷酸酶组化染色呈强阳性，骨形态发生蛋白免疫级化染色呈强阳性，钙红染色显示具有成骨能力；染色体数目形态保持相对稳定。结论：利用有限稀释和克隆传代培养筛选建立的成骨细胞株，生物学性状均一，遗传学性状稳定。

低频脉冲电磁场通过IGF-1R/NO信号通路促进大鼠颅骨成骨细胞成熟及矿化

目的:观察低频脉冲电磁场(PEMF)是否通过胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)/一氧化氮(NO)信号通路促进大鼠颅骨成骨细胞成熟及矿化。方法:体外分离培养乳鼠颅骨成骨细胞,传代后随机分成9组,每天用50 Hz 0.6 mT PEMF处理不同的时间,通过检测成骨细胞中NO含量确定PEMF最佳处理时长。将传代后的成骨细胞随机分成空白对照组、PEMF组、GSK(IGF-1R阻断剂)组、PEMF+GSK组,PEMF处理成骨细胞3 d后,采用蛋白质印迹法检测蛋白激酶(AKT)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和cGMP依赖性蛋白激酶(PKG)蛋白表达水平;PEMF处理第6天时测定碱性磷酸酶(ALP)活性;PEMF处理第12天时采用茜红素染色法观察钙化结节形成情况。结果:经1.5 h电磁场处理后的成骨细胞中NO含量显著提高(P<0.01),遂后续采用PEMF处理1.5 h。与空白对照组比较,PEMF组AKT、iNOS、PKG蛋白表达量增加(均P<0.01),ALP活性升高(P<0.05),且茜红素染色面积增大(P<0.01);GSK组AKT、iNOS、PKG蛋白表达量减少,ALP活性降低(P<0.05),茜红素染色面积最小(P<0.01);PEMF+GSK组上述实验结果均高于GSK组但低于PEMF组(P<0.05或P<0.01)。结论:PEMF可能通过IGF-1R/NO信号通路促进大鼠颅骨成骨细胞成熟与矿化。

槲寄生多糖促进小鼠颅骨前骨细胞系MC3T3-E1的增殖及抑制凋亡的机制

目的检测槲寄生多糖对小鼠颅骨前骨细胞(MC3T3-E1)增殖、凋亡的影响并探讨其机制。方法提取槲寄生多糖,分别配置成不同质量浓度(0. 625 g/L,1. 25 g/L,2. 5 g/L,5 g/L)作用MC3T3-E1小鼠颅骨前骨细胞及对照组。流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况,用Brd U和碱性磷酸酶(ALP)试剂盒分别检测细胞增殖及细胞外碱性磷酸酶分泌变化,通过Real-time PCR检测成骨细胞相关基因mRNA的表达水平。结果与对照组相比,药物处理组随槲寄生多糖浓度的上升,细胞周期S期和G2/M的占比增多,在AnnexinⅤ+/PI-象中的细胞百分数明显下降,细胞数量明显递增,细胞外ALP的活性呈明显递减,Runt相关转录因子2(Runtx2)、Ⅰ型胶原α1(COL1A1)链转录水平升高,且递增、递减效果都在2. 5 g/L浓度之后趋于平稳。而骨钙素(OC) mRNA表达水平逐渐升高,在1. 25 g/L之后平稳。结论槲寄生多糖能促进成骨细胞MC3T3-E1的增殖,抑制其凋亡,其机制可能与抑制碱性磷酸酶分泌以及促进骨钙素、Runt相关转录因子2、Ⅰ型胶原α1链的mRNA表达水平有关。

低频率低强度电磁场对体外培养大鼠颅骨成骨细胞成熟和矿化的影响

目的:比较研究50 Hz 1.8 mT正弦电磁场(SEMF)和50 Hz0.6 mT脉冲电磁场(PEMF)对大鼠颅骨成骨细胞成熟和矿化的影响。方法:原代培养大鼠颅骨成骨细胞,传代后随机分为空白对照组、SEMF组和PEMF组。SEMF组和PEMF组每天接受电磁场处理一次,每次90 min。电磁场处理2 d时,采用蛋白质印迹法和实时定量RT-PCR检测Ⅰ型胶原(Collagen-1)、骨形态发生蛋白2(BMP-2)、Osterix(OSX)和Runt相关转录因子2(Runx-2)的蛋白和基因表达;电磁场处理第6天和第9天时,采用碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测ALP活性;电磁场处理第10天时采用偶氮偶合染色检测ALP活性;电磁场处理第12天时,以茜素红染色观察钙化结节形成情况并作定量分析。结果:与空白对照组比较,SEMF组和PEMF组的Collagen-1、BMP-2、OSX、Runx-2蛋白和基因表达水平均显著升高(P<0.01或P<0.05),且Collagen-1、BMP-2在PEMF组中的mRNA表达量显著高于SEMF组(均P<0.05)。电磁场处理第6天时,PEMF组ALP活性显著高于空白对照组(P<0.05),SEMF组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);第9天时,PEMF组和SEMF组ALP活性均显著高于空白对照组(均P<0.01),而PEMF组和SEMF组之间差异无统计学意义(P>0.05)。PEMF组和SEMF组偶氮偶合染色面积均大于空白对照组(均P<0.01),且PEMF组染色面积大于SEMF组(P<0.05)。茜素红染色结果显示,PEMF组和SEMF组钙化结节染色面积显著大于空白对照组(均P<0.01),且PEMF组钙化结节染色面积大于SEMF组(P<0.01)。结论:50 Hz 1.8 mT SEMF和50 Hz 0.6 mT PEMF均能促进大鼠颅骨成骨细胞成熟和矿化,其中PEMF效果更为明显。

颅骨孤立性浆细胞瘤1例报告

患者女，61岁，因半年前开始出现左顶部头皮不适、麻木感，进而出现进展性头皮针刺样疼痛（触软、压之可凹陷），于2013年6月来我院就诊。查体：左颞顶部局限性肿物，约6cm×7cm大小，质软，皮温增高，皮色正常，无搏动感，活动度差。外院MRI检查示左侧颞顶部占位性病变，考虑脑膜瘤。人我院后行常规及增强CT检查，示左侧颞顶部肿瘤，颅骨侵蚀。

大鼠颅骨骨缝间充质干细胞与骨髓间充质干细胞成骨及成脂能力比较研究

目的分离培养大鼠颅骨骨缝间充质干细胞(CSSCs)、骨髓间充质干细胞(BMSCs),比较两种间充质干细胞体外成骨、成脂诱导的差异。方法采用出生后5天的SD大鼠,分离培养CSSCs和BMSCs,并进行鉴定。体外对CSSCs和BMSCs进行成骨成脂诱导,采用免疫荧光检测,碱性磷酸酶(ALP)染色,茜素红染色,油红O染色,以及western blot和RT-PCR检测,比较CSSCs和BMSCs成骨成脂能力。结果成功分离培养出CSSCs和BMSCs,流式细胞术检测结果与多潜能干细胞相符;成骨诱导后,CSSCs的Ⅰ型胶原、ALP阳性细胞更多,钙结节染色阳性区域更多;Western blot显示RUNX2、ALP、OCN蛋白含量在CSSCs中的表达分别是BMSCs的2.1、1.8、1.5倍,差异均有统计学意义(P<0.05);RT-PCR显示RUNX2、ALP、OCNmRNA在CSSCs中的表达分别是BMSCs的2.23、1.92、1.56倍,差异均有统计学意义(P<0.05);成脂诱导后,BMSCs油红O染色阳性细胞更多;western blot显示PPARγ和LPL蛋白在BMSCs中的表达分别是CSSCs的2.5、1.8倍,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论颅骨骨缝间充质干细胞和骨髓间充质干细胞均可向成骨细胞、成脂细胞分化,颅骨骨缝间充质干细胞的成骨能力高于骨髓间充质干细胞,成脂能力低于骨髓间充质干细胞。

淡豆豉和黑豆乙醇提取物的促成骨细胞增殖活性及HPLC-MS分析

目的比较分析淡豆豉和黑豆乙醇提取物促大鼠颅骨成骨细胞增殖活性及二者的化学成分。方法采用MTT法对淡豆豉和黑豆的乙醇提取物进行促大鼠颅骨成骨细胞增殖活性的研究,并通过高效液相色谱-质谱联用技术对二者化学成分进行比较分析。结果淡豆豉和黑豆的乙醇提取物对大鼠成骨细胞的促增殖率分别可达到36.5%和28.2%,其主要有效成分为异黄酮类化合物,经液质联用分析共鉴定出15个黄酮类成分。结论黑豆发酵成淡豆豉后的成分变化主要体现在由苷类成分脱糖转化为苷元,含有量显著增加的大豆苷元和染料木素两种苷元主要由丙二酰大豆苷(大豆苷元-G-M)和丙二酰染料木苷(染料木素-G-M)脱丙二酰基和葡萄糖转化而来。

成骨细胞特异性识别多肽对人成骨细胞增殖和矿化影响的实验研究

目的观察成骨细胞特异性识别多肽对人颅骨成骨细胞(HCO)增殖和矿化作用的影响。方法体外常规培养人颅骨成骨细胞,分为5个实验组(10^(-4)、10^(-5)、10^(-6)、10^(-7)、10^(-8)mol/L)以及空白对照组,MTT法检测细胞的增殖,紫外分光光度法检测细胞碱性磷酸酶(ALP)的表达,茜素红染色及半定量分析检测细胞矿化程度,RT-QPCR法检测细胞骨钙素(OCN)mRNA的表达。结果此浓度范围内的特异性多肽对成骨细胞增殖有促进作用(P<0.05),最大效应浓度是10^(-5)mol/L;能增加ALP活性(P<0.05),最大效应浓度是10^(-4)mol/L。通过茜素红染色观察和半定量分析,14、21 d实验组钙盐沉积量高于对照组,半定量分析结果显示浓度10^(-5)mol/L时,吸光度(OD)值最高,但差异无统计学意义;RT-QPCR法显示14、21 d实验组OCN mRNA表达量均高于对照组(P<0.05)。结论 10^(-8)~10^(-4)mol/L浓度范围的成骨细胞特异性识别多肽能够促进人颅骨成骨细胞的增殖和矿化,且在10^(-5)mol/L浓度促进成骨细胞增殖及矿化相关蛋白表达最为显著。

骨松康含药血清对成骨细胞生物学活性的影响

目的观察骨松康对体外培养成骨细胞增殖和分化的影响。方法分离培养乳鼠颅骨成骨细胞,加入中药骨松康吸收后血清,流式细胞仪和碱性磷酸酶活性检测、骨钙素免疫组化染色、矿化结节计数分析其对成骨细胞增殖和分化的影响。结果以含药血清培养的成骨细胞,S期细胞比例增多,说明细胞DNA的合成增加;碱性磷酸酶活性及骨钙素表达增强;形成矿化结节数及分泌胰岛素样生长因子I(IGF-1)的含量均明显高于对照血清组(P<0·01)。结论骨松康含药血清能直接促进体外培养的大鼠成骨细胞的增殖、分泌和矿化,提高了成骨细胞骨形成功能。

阿胶强骨口服液含药血清对胎鼠成骨细胞护骨素及护骨素配体mRNA表达的影响

目的研究阿胶强骨口服液含药血清对胎鼠成骨细胞中OPG、RANKL表达的影响,探讨阿胶强骨口服液治疗骨质疏松的分子机制。方法 3月龄Wistar大鼠(雌雄各半)30只,随机分为阿胶强骨口服液,雌激素,及生理盐水对照组,灌胃7d后,制备实验组和对照组的含药血清。将新生SD大鼠分离的颅骨成骨细胞,制成单细胞悬液,消化传代,取二代培养的成骨细胞,制成细胞悬液。培养细胞被分为5组,分别加同体积药液,对照组仅加培养液,继续培养。采用MTT比色分析、3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入法测定成骨细胞增殖,用放免法测定细胞内BGP含量,RT-PCR测定胎鼠成骨细胞中OPG、RANKL mRNA的表达。结果阿胶强骨口服液含药血清以剂量依赖方式促进成骨细胞的增殖,与对照组相比,差异显著(P<0．05)。成骨细胞OPG基因mRNA表达在阿胶强骨口服液含药血清100ml／L时最强,与雌激素组比较无显著性差异(P>0 05),且明显高于对照组(P<0．05)。成骨细胞RANKL基因mRNA表达在1000ml／L阿胶强骨口服液含药血清与雌激素组比较无显著性差异(P<0 05),且明显低于对照组(P<0．05)。结论阿胶强骨口服液可在细胞水平上促进骨的合成代谢及前成骨细胞的有丝分裂,分子水平上调节 OPG／RANKL表达而治疗骨质疏松。

成骨细胞特异性识别多肽对人成骨细胞黏附和迁移作用的实验研究

目的探讨成骨细胞特异性识别多肽对人颅骨成骨细胞黏附和迁移作用的影响。方法常规培养人颅骨成骨细胞,分为10^(-4)、10^(-5)、10^(-6)、10^(-7)、10^(-8)mol/L 5个实验组及对照组,应用黏附实验、划痕实验及Transwell迁移小室实验检测不同浓度的成骨细胞特异性识别多肽对人成骨细胞黏附、迁移作用的影响。结果成骨细胞特异性识别多肽在10^(-8)~10^(-4)mol/L浓度范围内能够促进人颅骨成骨细胞迁移与黏附,其中10^(-5)mol/L浓度促进作用最为显著。结论成骨细胞特异性识别多肽能够促进成骨细胞黏附及迁移。