大鼠颈动脉球囊损伤模型的竞争性内源RNA调控网络研究

目的构建大鼠颈动脉球囊损伤模型的竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)调控网络,筛选血管新生内膜形成中的关键调控基因。方法首先建立大鼠颈动脉球囊损伤模型。将12只SD大鼠随机分为2组(每组6只):手术组,利用2F取栓球囊于左颈总动脉行球囊损伤术;假手术组:夹闭左颈总动脉,使血流阻断时间接近球囊损伤术操作时间。术后14 d取颈总动脉血管组织,提取总RNA,进行长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和信使mRNA(messenger RNA,mRNA)测序。应用生物信息学方法进行差异表达lncRNA和mRNA共表达分析、基因功能(Gene Ontology,GO)和信号通路(Pathway)分析;通过数据库预测微小RNA(microRNA,miRNA)与lncRNA及mRNA的结合关系,并从中筛选已报道在大鼠血管内膜增生过程中有生物学功能的miRNA相关的结合关系,得到最终的ceRNA网络。结果与假手术组相比,手术组鉴定出1731个差异表达的mRNAs和99个差异表达的lncRNAs;GO和Pathway分析显示,差异表达的mRNA主要参与调节免疫反应、细胞迁移、细胞黏附等。ceRNA分析构建了由46个mRNAs、18个lncRNAs和16个miRNAs组成的ceRNA网络,其中AABR07073245.1、Col6a3、AABR07071659.2和AABR07067310.2所介导的ceRNA调控轴可能在大鼠血管新生内膜形成中具有重要调控作用。结论本研究系统分析大鼠颈动脉球囊损伤模型表达谱,构建的ceRNA调控网络可能在大鼠血管内膜增生过程中具有重要调控作用,有望为动脉粥样硬化的防治提供新的靶点与分子标志物。

骨髓间充质干细胞源外泌体对大鼠颈动脉球囊损伤后circRNA和microRNA差异表达的影响

目的骨髓间充质干细胞(BMSCs)能够在多种心血管疾病病理过程中发挥重要作用,但其对支架内再狭窄的影响有待进一步研究。文中旨在探讨BMSCs源外泌体对大鼠颈动脉球囊损伤后新生内膜增殖的影响及circRNA和microRNA表达变化。方法采用差速超速离心法提取大鼠BMSCs源外泌体,并使用Western blot及透射电镜对其进行鉴定。采用球囊损伤大鼠颈动脉的方法建立血管内膜增生动物模型,将36只成年雄性SD大鼠随机分为:假手术组、损伤组、外泌体组(400μL);假手术组大鼠只分离颈左总动脉血管,其余各组大鼠的左颈总动脉均行球囊损伤,外泌体组行球囊损伤后立即原位注射400μL BMSCs源外泌体并用微型血管夹夹闭血管5 min。采用HE染色检测内膜增生情况,DCFH-DA染色检测血管活性氧(ROS)释放情况。采用circRNA和microRNA芯片筛查差异表达的circRNA和microRNA,并以每组3个样本对其中显著差异的8个circRNA和7个microRNA进行qRT-PCR验证,并筛选出BMSCs源外泌体处理后差异表达的circRNA和microRNA;生物信息学方法预测差异microRNA的靶基因,并进行GO分析和KEGG通路分析,构建circRNA-microRNA-mRNA共表达网络,对其潜在分子机制进行探讨。结果透射电镜及Western blot验证提取的囊泡状物质为外泌体;HE染色结果显示:损伤组较假手术组新生内膜增殖明显,其内膜/中膜面积比(1.902±0.217)较假手术组(1.000±0.000)显著增加(P<0.05);外泌体组较损伤组新生内膜增殖程度有所减低,其内膜/中膜面积比(0.982±0.067)较损伤组明显减低(P<0.05)。DCFH-DA染色结果显示:与假手术组DCFHA红色荧光强度(4.730±0.104)相比,损伤组(16.800±0.380)明显增强(P<0.05);与损伤组相比,外泌体组DCFHA红色荧光强度(12.810±0.094)明显减弱(P<0.05)。circRNA芯片显示差异性表达的circRNA共1683个(Fold change≥2,P<0.05)。与假手术组相比,损伤组中上调的有631个,下调的有1052个。microRNA芯片显示有差异microRNA共44个(Fold change≥2,P<0.05),且均在损伤组上调。GO分析和KEGG分析表明,microRNA的预测靶基因参与了细胞生物学进程正向调控、细胞间紧密连接、激酶活性等方面有关,并在MAPK信号通路、Ras信号通路、Hippo信号通路等等中富集。结合芯片和qRT-PCR结果,筛选出BMSCs源外泌体处理后损伤颈动脉组织中差异表达明显的有circRNA_004976、circRNA_008565、circRNA_017449以及miR-20a-5p、miR-146a-5p、miR-21-5p(P<0.05)。结论BMSCs源外泌体可以抑制大鼠颈动脉球囊损伤后内膜增生,其潜在机制可能与circRNA_004976、circRNA_008565以及miR-20a-5p、miR-21-5p等分子调控细胞增殖、迁移有关。

^(32)P球囊内放射治疗预防动脉损伤后新生内膜过度增生

目的:选用家兔颈动脉球囊损伤模型观察放射性32P液体球囊血管内放射治疗对损伤后新生内膜过度增生的抑制作用。方法:健康家兔40只制作颈动脉球囊损伤模型,随机分成4组:10、20和40GY放射剂量治疗组和对照组。分别于术后3、7、14、28和56天处死动物,取颈动脉标本HE染色、原位标记凋亡细胞(TUNEL)和增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组化染色,应用光学显微镜和计算机图像分析系统对切片进行图像分析,计算动脉中膜血管平滑肌细胞凋亡率、PCNA阳性率、内膜和中膜厚度及面积、残余管腔面积。结果:球囊损伤后动脉中膜平滑肌细胞开始增殖,并向内膜下迁移,其凋亡率和PCNA细胞阳性率均在伤后7天达到高峰。各治疗组各时间段血管平滑肌细胞凋亡率高于对照组(P<0.01),PCNA细胞阳性率低于对照组(P<0.01),20GY和40GY组相似,但都优于10GY组(P<0.01);伤后28天始血管内膜和中膜增厚,面积增加,残余管腔面积缩小,各治疗组伤后28天始血管内膜、中膜增厚面积增加和残余管腔面积缩小明显改善(P<0.01),20GY和40GY组相似,但都优于10GY组(P<0.01)。结论:放射性32P液体球囊血管内放射治疗可以明显抑制球囊损伤后动脉血管壁平滑肌细胞的增殖和迁移,减少新生内膜过度增生,预防管腔狭窄。