人颌骨间充质干细胞的外泌体在巨噬细胞调控中的作用

目的:探讨颌骨骨髓间充质干细胞分泌的外泌体(OMMSCs-Exo)的特性及其在调控巨噬细胞功能中可能发挥的作用。方法:体外培养OMMSCs,检测其克隆形成及多向分化能力。提取上清液中外泌体,透射电镜观察其形态,蛋白印迹法检测其表面特异标志CD63、CD81。将外泌体与巨噬细胞作用24 h后用共聚焦显微镜观察两者的作用方式,实时定量PCR检测外泌体内免疫相关miR-223和miR-let-7c表达及与共培养后巨噬细胞中miRNA表达。结果:人OMMSCs符合间充质干细胞特性,OMMSCs-Exo分泌的外泌体近似圆形,直径在60~160 nm之间,表达表面标志CD63、CD81:内含有与巨噬细胞调控相关的miRNA如miR-223和miR-let-7c等,能被巨噬细胞吞噬,共培养后巨噬细胞中miR-223含量增加。结论:人OMMSCs-Exo及其携带的miRNA可能参与了巨噬细胞功能的调控。

淫羊藿次苷对犬颌骨间充质干细胞增殖与成骨分化的影响

目的:研究淫羊藿次苷Ⅱ(IcarisidⅡ,ICSⅡ)对体外培养的比格犬颌骨间充质干细胞(alveolar bone-derived stem cells,AMSCs)增殖与成骨分化的影响。方法:取比格犬颌骨骨片,体外分离培养出dAMSCs,传代至第4代,做多向分化鉴定。以10^-5、10^-6、10^-7、10^-8、10^-9mol/L浓度的ICSⅡ刺激d AMSCs后,取1、3、5、7 d的细胞,分别用CCK-8及碱性磷酸酶(ALP)试剂盒检测dAMSCs的增殖及ALP活性;用10^-6 mol/L的ICSⅡ处理dAMSCs后14 d,作ALP染色,21 d时作茜素红染色,以判断ICSⅡ对细胞分化及矿化能力的影响。在成骨诱导及10^-6mol/L的ICSⅡ药物诱导第4、8天后,用蛋白免疫印迹试验分析成骨相关蛋白OSX、Runx-2及OCN的表达量;在诱导第6天时,利用RT-PCR分析成骨相关基因OSX、bFGF、Runx-2及OCN的表达情况。采用SPSS 22.0软件包进行统计分析。结果:原代培养的dAMSCs贴壁生长,呈梭形,具备多向分化能力;ICSⅡ在不同浓度下均可促进dAMSCs的增殖,其ALP活性亦有提高,且在实验浓度时可观察到钙结节形成。各成骨相关基因在ICSⅡ诱导后表达量有不同程度增加,均高于完全培养基组。随着时间延长,加药组Runx-2蛋白表达量有所下降,OCN蛋白表达量逐渐增多,与对照组差距加大;OSX的蛋白表达量虽高于对照组,但无统计学差异。结论:ICSⅡ可促进dAMSCs的增殖及成骨分化。

颌骨来源骨髓间充质干细胞成骨分化的特点、优势与应用

背景:颌面部骨组织缺损修复是目前研究的热点与难点,而种子细胞的选择是关键。颌骨来源骨髓间充质干细胞是存在于颌骨内的成体间充质干细胞,在颌面部组织再生方面的应用更具优势。目的:综述颌骨来源骨髓间充质干细胞的生物学特性和成骨分化优势以及药物、体内环境、微小RNA对其成骨分化影响的相关研究进展。方法:利用计算机在PubMed和中国知网进行文献检索。中文检索词为“口腔,骨组织工程,干细胞”,英文检索词为“oral,bone tissue engineering,stem cells”。共检索下载文章405篇,根据纳入与排除标准对文章进行筛选,最终纳入70篇文献进行综述。结果与结论:颌骨来源骨髓间充质干细胞是口腔骨组织工程的优良种子细胞,与长骨骨髓间充质干细胞相比,颌骨来源骨髓间充质干细胞具有更强的增殖能力和成骨分化能力。药物、体内环境、微小RNA均可以调控颌骨来源骨髓间充质干细胞的成骨分化,但目前对颌骨来源骨髓间充质干细胞的研究尚处于初始阶段,因此需要更多论证力较强的研究来证实其在颌面部骨组织再生领域的应用更具优势。

槐角提取物对颌骨骨髓间充质干细胞成骨向分化的影响

目的 :探讨槐角提取物对颌骨骨髓间充质干细胞(jaw bone marrow mesenchymal stem cells,jBMSCs)成骨分化的影响。方法:采用CCK-8法检测10、25、50、100μmol/L槐角提取物溶液对jBMSCs增殖的影响,采用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色、茜素红染色检测10、25、50μmol/L槐角提取物溶液对jBMSCs成骨分化水平的影响,采用蛋白免疫印迹试验(Western blot)和实时定量荧光PCR检测槐角提取物溶液对jBMSCs成骨分化相关分子的蛋白和mRNA表达水平的影响。采用GraphPad Prism 9软件包对数据进行统计学分析。结果:100μmol/L槐角提取物溶液对jBMSCs有明显毒性作用(P<0.0001),10、25和50μmol/L浓度不影响细胞增殖(P>0.05)。与对照组相比,10、25和50μmol/L组的碱性磷酸酶活性、钙结节数量、成骨分化相关分子的蛋白和mRNA表达水平均逐渐升高。结论:10、25、50μmol/L浓度的槐角提取物能促进jBMSCs成骨向分化。

MYSM1对大鼠颌骨骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化能力的影响

背景去泛素化酶能够调控骨骼生长发育,MYSM1基因缺失会造成全身骨骼疏松,当前并无MYSM1对颌骨发育影响的研究。目的探讨MYSM1对颌骨来源的骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。方法分离10只8周Wistar大鼠下颌骨,利用组织消化法分离培养颌骨骨髓间充质干细胞(jaw bone marrow mesenchymal stem cells,JBMMSCs)。取生长良好的第3~5代JBMMSCs进行成骨诱导,利用qPCR、Western blot技术检测成骨标志物OCN、Runx2、ALP及去泛素化酶MYSM1的变化。分别利用空转染慢病毒和MYSM1敲低的慢病毒转染JBMMSCs,设置对照组和敲低组细胞,qPCR检测敲低效率。CCK-8、细胞克隆形成实验检测其敲低MYSM1对细胞的增殖能力影响,细胞划痕实验检测细胞迁移能力。空转染慢病毒和敲低MYSM1的JBMMSCs成骨诱导7 d后利用qPCR技术、ALP、茜素红染色检测成骨的表达变化。结果JBMMSCs成骨诱导成功后,MYSM1的mRNA和蛋白表达水平升高(P<0.05)。CCK-8显示对照组和敲低组的细胞增殖能力无统计学差异(P>0.05),两组间细胞集落形成实验和细胞迁移能力有统计学差异(P<0.05)。敲低组JBMMSCs在成骨诱导7 d后OCN、Runx2、ALP的mRNA表达水平降低(P<0.05),ALP、茜素红染色浅于对照组。结论敲低MYSM1并未对JBMMSs的增殖和迁移能力造成显著影响,而敲低MYSM1的JBMMSCs成骨分化能力降低。

颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化过程中线粒体功能变化的研究

背景线粒体对成骨分化起着关键调控作用,但颌骨骨髓间充质干细胞(jaw bone marrow mesenchymal stem cells,JBMMSCs)成骨分化过程中线粒体功能的变化尚不明确。目的探究JBMMSCs成骨分化过程中线粒体功能的变化。方法提取小鼠JBMMSCs进行培养并进行鉴定。采用第3代JBMMSCs接种于孔板内,设置为对照组、成骨诱导3 d组、成骨诱导7 d组;检测ATP含量和柠檬酸合酶活性;RT-qPCR检测线粒体功能相关标志物MFN1、MFN2、NRF1、PGC-1α的mRNA表达;Western blot分析线粒体功能相关标志物MFN1、MFN2、FIS1、COXⅣ的蛋白表达;JC-1染色评估线粒体膜电位。结果提取的JBMMSCs形态呈长梭形,具有三向分化潜能。与对照组相比,成骨诱导7 d时,ATP含量和柠檬酸合酶活性增加(P均<0.05);RT-qPCR结果表明,线粒体功能相关标志物MFN1、MFN2、NRF1、PGC-1α的mRNA表达上调(P<0.05);Western blot结果显示,MFN1、MFN2、FIS1、COXⅣ的蛋白表达上调(P均<0.05);JC-1染色结果证实,线粒体膜电位升高(P<0.05)。结论JBMMSCs成骨分化过程中线粒体功能相关标志物均表达上调,提示线粒体功能增强。

糖尿病骨质疏松来源颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化能力的研究

目的探究糖尿病骨质疏松来源颌骨骨髓间充质干细胞(rJBMMSCs)成骨分化能力及生物学特性是否发生改变。方法使用GK大鼠建立糖尿病骨质疏松(DOP)模型,建模成功后取大鼠下颌骨提取细胞,并进行干细胞鉴定,以正常Wistar大鼠作为对照组。CCK-8检测细胞增殖能力,平板克隆法检测细胞克隆形成能力,划痕实验检测细胞迁移能力,流式细胞术检测细胞周期。通过碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红(ARS)染色、qRT-PCR以及Westernblot检测其成骨分化能力。结果DOPrJBMMSCs的细胞增殖能力、克隆形成能力、细胞迁移能力均较对照组减弱。ALP染色及活性分析显示DOP组较对照组染色面积小且颜色浅,ALP活性显著降低。ARS染色显示DOP组矿化结节明显较对照组少,其OD值明显小于对照组。qRT-PCR以及Western blot结果显示DOP组的成骨相关因子在mRNA水平及蛋白水平表达均显著下降。结论相较于对照组,DOP rJBMMSCs的生物学特性发生改变,其成骨分化能力明显受损。

lncRNA SNHG8抑制颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化功能

目的:研究lncRNA SNHG8对颌骨骨髓间充质干细胞(JBMMSCs)成骨分化的影响。方法:通过慢病毒转染敲除或过表达JBMMSCs中lncRNA SNHG8,实时荧光定量PCR检测基因表达,碱性磷酸酶(ALP)活性测定、茜素红染色、钙离子定量以及Western blot检测JBMMSCs的体外成骨分化能力,活性氧(ROS)染色检测ROS含量;lncRNA SNHG8敲低后的JBMMSCs与HA/TCP材料混合并植入裸鼠皮下,苏木素-伊红(HE)染色、Masson染色、免疫荧光染色检测JBMMSCs的体内成骨分化能力。结果:体外JBMMSCs中lncRNA SNHG8敲低后的ALP活性及体外矿化能力增强(P<0.01),骨涎蛋白(BSP)蛋白表达条带增强,lncRNA SNHG8过表达后ALP活性及体外矿化能力减弱(P<0.01),BSP蛋白表达条带减弱;敲除lncRNA SNHG8可上调MAPK通路中磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK),过表达SNHG8可抑制p-JNK表达;敲除lncRNA SNHG8可增强胞内ROS染色,过表达lncRNA SNHG8可抑制胞内ROS染色。lncRNA SNHG8敲除后的体内新骨形成增加(P<0.01),BSP、骨钙素(OCN)蛋白表达条带增强。结论:lncRNA SNHG8可通过JNK信号通路抑制JBMMSCs体内外成骨分化功能。

TGF-β信号通路对牙源性黏液瘤来源的间充质干细胞成骨分化的影响分析

目的探究转化生长因子-β(TGF-β)信号通路对牙源性黏液瘤(OM)来源的间充质干细胞(OMMSC)成骨分化的影响。方法选择2018年至2020年南京大学医学院附属口腔医院收治的OM患者2例,经手术取部分病灶标本进行OMMSC分离培养。另外选择于该院接受牙种植治疗的年轻患者5例,抽取颌骨骨髓进行颌骨骨髓来源的间充质干细胞(JBMSC)分离培养。通过细胞增殖实验、流式细胞术检测、茜素红S染色进行细胞鉴定。成骨培养7 d后通过实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测TGF-β信号通路以及成骨相关基因的表达情况。观察小分子药物SB431542及TGF-β1干预对OMMSC、JBMSC成骨分化能力的影响。结果经分离获得的OMMSC、JBMSC具有梭形形态,表达间充质干细胞表面标志物,并具有成骨分化能力,符合间充质干细胞的特征。与JBMSC相比,OMMSC具有更强的增殖能力。RT-PCR检测结果显示,TGF-β/Smad信号相关因子在OMMSC中呈高表达(P<0.05),成骨相关因子骨桥蛋白(OPN)表达降低(P<0.05)。茜素红S染色结果显示SB431542可显著促进OMMSC成骨分化,而TGF-β1对OMMSC成骨分化有抑制作用。结论该研究成功对OMMSC进行了分离,发现TGF-β信号相关因子在OMMSC中呈高表达,抑制TGF-β信号转导通路可增强OMMSC的成骨能力,为改善OM患者骨缺陷提供参考。

神经生长因子对小鼠颌骨骨髓间充质干细胞增殖、迁移、分化及凋亡的影响

背景神经生长因子(nerve growth factor,NGF)是神经营养因子中的一类,能够促进中枢及外周神经元加速生长,修复损伤的神经系统,有研究证实NGF能促进中胚层来源的长骨骨髓间充质干细胞的成骨分化及骨形成,而NGF对外胚层来源的颌骨骨髓间充质干细胞(jaw bone marrow mesenchymal stem cells,JBMMSCs)生物学特性的影响尚不明确。目的探讨NGF对JBMMSCs增殖、迁移、分化及凋亡特性的影响。方法原代培养小鼠JBMMSCs并鉴定。取第二代JBMMSCs加入含50 ng/mL NGF培养液孵育72h后,通过CCK-8、qRT-PCR、Western blot及免疫荧光(immunofluorescence,IF)等方法检测细胞增殖及其相关标志物MCM-2、Ki67的表达;qRT-PCR、Western blot检测凋亡相关标志物Bcl-3、Bax的表达;划痕实验检测JBMMSCs迁移能力;碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色、qRT-PCR、Western blot及IF检测成骨相关标志物表达。结果CCK-8结果显示,50 ng/mL NGF可显著增强JBMMSCs第3天及第5天的OD值,Western blot及IF结果显示,50 ng/mL NGF可显著增强JBMMSCs中增殖标志物Ki67、MCM-2的蛋白水平;划痕实验结果显示,50 ng/mL NGF可显著提高JBMMSCs的迁移率,有效缩小各个时间点的划痕面积;50 ng/mL NGF可有效增强JBMMSCs的碱性磷酸酶活性,上调ALP、OCN、RUNX2、BMP2的mRNA表达水平及ALP、OCN、BMP2、OPN、RUNX2的蛋白水平;此外,50 ng/mL NGF还可上调Bcl-2的mRNA及蛋白表达水平,下调Bax的mRNA及蛋白表达水平。结论50 ng/mL NGF能有效提高JBMMSCs增殖、迁移及成骨分化能力,同时抑制其凋亡。

2型糖尿病对大鼠颌骨骨髓间充质干细胞生物学特性的影响及其机制研究

背景2型糖尿病患者骨代谢异常,颌骨骨质和骨量都发生明显改变,是牙周炎的全身促进因素之一。Wnt信号通路可以促进干细胞矿化并修复骨组织缺损。然而2型糖尿病影响下Wnt信号通路是否参与了对颌骨骨髓间充质干细胞(jaw bone marrow mesenchymal stem cells,JBMMSCs)的成骨分化调控仍未可知。目的研究2型糖尿病对大鼠JBMMSCs增殖及分化等生物学特性的影响,并对其机制进行初步探索。方法选取连续两周随机血糖≥16.7mmoL/L的13周龄GK大鼠为2型糖尿病组,相同周龄的Wistar大鼠作为对照组,两组各10只;无菌条件下采用骨髓冲洗法与骨片消化法相结合的方法分离培养两组JBMMSCs作为研究对象。CCK-8法检测并比较两组细胞增殖能力,流式细胞术检测细胞被诱导凋亡的能力。对JBMMSCs进行成骨、成脂诱导后,qRT-PCR评估成骨、成脂及Wnt信号通路相关基因的表达改变,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色检测成骨诱导后ALP的表达变化,茜素红染色比较钙结节形成能力,油红O染色检测成脂诱导后脂滴形成能力。结果与对照组相比,2型糖尿病组JBMMSCs的增殖及克隆形成能力降低,凋亡早期与晚期的细胞比例增加(P<0.05)。两组JBMMSCs成骨诱导后成骨相关基因ALP、OCN和Runx2 mRNA表达升高,但2型糖尿病组低于对照组(P<0.05),2型糖尿病组钙结节形成能力和ALP染色面积及密度较对照组低(P<0.05)。成脂诱导后,成脂相关基因的表达和脂滴的形成较对照组减少(P<0.05)。2型糖尿病组JBMMSCs成骨诱导7 d后Wnt信号通路相关分子Wnt4、Wnt5a、Wnt7b的mRNA表达较对照组升高,β-catenin的表达水平较对照组低。结论2型糖尿病影响大鼠颌骨骨髓间充质干细胞的增殖和克隆、抑制成骨及成脂分化能力,其成骨能力的降低可能与Wnt信号通路相关。

低氧条件下颌骨骨髓间充质干细胞生物学活性及长链非编码RNAs表达谱差异的分析

背景近年来,颌骨骨髓间充质干细胞(jaw bone marrow-derived mesenchymal stem cell,JBMMSCs)以其优秀的生物学特性备受瞩目。低氧作为一种常见的微环境,在增强JBMMSCs抗性方面发挥的作用尚未见报道,值得探究。目的探索低氧对JBMMSCs生物学活性的影响以及低氧处理JBMMSCs后差异表达的长链非编码RNA(long noncoding RNAs,lncRNAs)及mRNAs,为进一步探究lncRNAs在调控JBMMSCs生物学性能中的作用机制提供理论基础。方法从C57BL/6N小鼠下颌骨中分离培养JBMMSCs并对其进行鉴定。利用50μmol/L氯化钴(CoCl_(2))培养JBMMSCs,建立JBMMSCs低氧细胞模型,以常氧条件下细胞为对照,通过免疫荧光、Western blot检测低氧诱导因子-1α(hypoxiainducible factor-1α,HIF-1α)的表达情况,对细胞模型进行验证。在此基础上,区分低氧和常氧组,通过CCK-8、细胞划痕实验及Ki67免疫荧光染色观察低氧对JBMMSCs增殖、迁移等的影响。对低氧及常氧条件下的JBMMSCs进行高通量测序,以|log2FC|≥1且P<0.05为筛选标准,筛选差异表达的lncRNAs和m RNAs,并对其生物学功能和作用机制进行预测。结果从小鼠下颌骨中提取的JBMMSCs呈长梭形、漩涡状生长,经鉴定符合间充质干细胞特点。采用50μmol/L CoCl_(2)处理72 h后低氧标记物HIF-1α表达较对照组升高(P=0.0023)。CCK-8和Ki67免疫荧光染色结果显示,低氧可促进JBMMSCs的增殖能力(P=0.0057)。细胞划痕实验结果显示,低氧可增强JBMMSCs迁移能力(P=0.0040)。利用高通量测序技术,筛选出低氧条件下12个差异表达的lncRNAs,其中4个表达上调,8个表达下调。利用生物信息学分析对差异最为显著的lncRNA-4632427E13Rik的下游miRNAs和靶基因进行预测,初步形成lncRNA-miRNA-mRNA互作网络。通过GO和KEGG分析发现,低氧处理后可显著富集到14条信号通路,并且其中多条信号通路可能与调控干细胞增殖分化和可塑性维持相关。结论低氧可促进JBMMSCs的增殖、迁移等能力,预测lnc-4632427E13Rik可能在低氧调控JBMMSCs生物学性能过程中发挥作用。

氯化锂对人颌骨来源的骨髓间充质干细胞增殖及骨向分化能力的影响

目的:探讨氯化锂(LiCl)对颌骨来源的骨髓间充质干细胞(OF-BMMSCs)增殖及骨性分化的影响。方法:采用有限稀释法克隆化培养人颌骨来源的骨髓间充质干细胞;正常培养基中加入不同浓度LiCl(5、10、20、40 mmol/L),同时设立对照组(0 mmol/L);运用MTT法分析不同浓度LiCl对人OF-BMMSCs增殖活性的影响;采用组织化学染色法、RT-PCR法测定不同浓度LiCl处理人OF-BMMSCs后的ALP活性及相关骨向分化基因(ALP,Runx-2,OCN)的表达。结果:5 mmol/L LiCl促进OF-BMMSCs增殖,对ALP、Runx-2、OCN表达的影响作用不明显(P>0.05),20和40 mmol/L LiCl抑制细胞增殖(P<0.05),促进ALP、Runx-2、OCN基因表达(P<0.05)。结论:LiCl能够促进人OF-BMMSCs的骨向分化。

miR-34a对人颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的:研究miR-34a对人颌骨骨髓间充质干细胞(hOBMSCs)成骨分化的影响。方法:实时定量RT-PCR检测miR-34家族在hOBMSCs成骨诱导过程中的表达情况;采用碱性磷酸酶及茜素红染色检测miR-34a对于hOBMSCs成骨分化能力的影响;Western blot检测hOBMSCs成骨分化过程中miR-34a对于成骨相关蛋白的影响,同时检测hOBMSCs在正常培养条件下miR-34a对于DKK1蛋白表达的影响;双荧光素酶报告基因检测miR-34a与DKK1的靶向关系;通过裸鼠皮下成骨实验检测miR-34a对于hOBMSCs体内成骨的影响。结果:在hOBMSCs成骨诱导过程中,miR-34家族的miRNA表达量均显著上升(P<0.05),其中miR-34a最为明显;过表达miR-34a可显著提高hBMSCs的体外成骨能力;miR-34a可以负向调节DKK1,同时双荧光素酶报告基因实验证实DKK1为miR-34a的靶基因;体内实验同样证实miR-34a可以促进hOBMSCs的成骨分化。结论:miR-34a可能通过抑制DKK1的表达,促进hOBMSCs的成骨分化。

衰老性骨质疏松微环境对颌骨骨髓间充质干细胞生物学功能的影响

目的:探讨衰老性骨质疏松微环境对颌骨骨髓间充质干细胞(Jaw bone-marrow-derived mesenchymal stem cells,JBMMSCs)生物学功能的影响。方法:分别取2月龄和20月龄SD(Sprague Daw ley)大鼠,分离其颌骨和股骨,并进行Micro-CT扫描,确定衰老性骨质疏松大鼠模型建立成功;体外分离、培养并鉴定两组大鼠的JBMMSCs,通过克隆形成实验、CCK8实验和成骨诱导观察其增殖和成骨分化能力;并采用实时定量荧光PCR技术(Real-time PCR)对成骨诱导7d后的JBMMSCs成骨重要相关基因Runx2、OCN进行检测。结果:与2月龄大鼠相比,20月龄大鼠颌骨、股骨均出现了明显的骨质疏松,主要表现为骨密度及骨小梁强度下降;年轻和衰老大鼠JBMMSCs阳性表达CD29、CD90,阴性表达CD34、CD45,符合间充质干细胞特性;衰老组JBMMSCs的增殖、成骨分化能力以及Runx2 mRNA、OCN mRNA表达水平均显著下降(*P<0. 05)。结论:JBMMSCs增殖和成骨分化能力降低可能是导致颌骨骨质疏松的重要原因。

神经生长因子对小鼠颌骨骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的影响

目的:研究不同浓度神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对外胚层来源的颌骨骨髓间充质干细胞(jaw bone marrow mesenchymal stem cells,JBMMSCs)增殖及成骨分化的影响。方法:原代培养小鼠JBMMSCs并鉴定。然后分四组分别加入含0 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml NGF培养液至第二代JBMMSCs中孵育3天,采用CCK-8检测JBMMSCs增殖,碱性磷酸酶试剂盒、qRT-PCR检测ALP、OCN、BMP2、RUNX2等重要成骨及增殖标记物Ki67、MCM-2的表达,Western blot检测OPN、RUNX2以及Ki67、MCM-2的表达。结果:采用骨片贴壁法原代培养的小鼠JBMMSCs经流式细胞术鉴定,表明成功获取JBMMSCs。CCK-8显示3种浓度的NGF均能促进JBMMSCs增殖,且呈浓度依赖性特点。qRT-PCR结果显示:ALP、OPN、RUNX2、BMP2、Ki67、MCM-2表达水平随浓度的升高而增加,但Ki67、MCM-2表达量在100 ng/ml NGF时下降。Western blot结果显示,OPN、Ki67、MCM-2蛋白表达随着NGF浓度的升高而增加,而RUNX2的蛋白表达则在100 ng/ml NGF时呈现下降趋势。结论:一定浓度的NGF可促进JBMMSCs增殖及成骨分化,50 ng/ml为NGF作用的最佳浓度。

川续断皂苷Ⅵ对人颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨川续断皂苷Ⅵ(asperosaponinⅥ,ASAⅥ)对人颌骨骨髓间充质干细胞(human jaw bone marrow mesenchymal stem cells,hj BMSCs)成骨分化的影响。方法流式鉴定提取的hj BMSCs表面的特异性抗原;CCK8检测1×10^(-4)、1×10^(-5)、1×10^(-6)、1×10-7、1×10^(-8) mol/L的ASAⅥ药物溶液对hj BMSCs增殖的影响;用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色、茜素红染色(alizarin red stain,ARS)及免疫印迹分析(western-blot,WB)验证ASAⅥ促进hj BMSCs成骨分化作用的同时,确定ASAⅥ促进hj BMSCs成骨分化合适浓度。用实时定量荧光PCR(real-time quantitative PCR,RT-PCR)进一步探索,在mRNA水平,ASAⅥ对hj BMSCs成骨分化的影响。结果实验结果表明,1×10^(-4)mol/L的ASAⅥ对hj BMSCs有明显的毒性作用(P<0.01),1×10^(-8)~1×10^(-5)mol/L对细胞增殖无明显毒性作用。与对照组相比,1×10^(-5) mol/L、1×10^(-6)mol/L ASAⅥ组的碱性磷酸酯酶、钙结节沉淀、成骨分化特异性蛋白表达量均明显升高。与对照组相比,1×10^(-5)mol/L、1×10^(-6) mol/L组的Runx2、OCN和COL-Ⅰ在mRNA水平的表达均明显上升(P<0.01),且前者略显优势。结论1×10^(-5)、1×10^(-6) mol/L的ASAⅥ均能较好促进hj BMSCs成骨分化,且1×10^(-5)mol/L略显优势。

糖尿病大鼠颌骨结构及颌骨骨髓间充质干细胞成骨分化的研究

目的:研究糖尿病对大鼠颌骨结构和颌骨来源骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化能力的影响,并初步探讨其可能的机制。方法:采用链脲佐菌素腹腔注射建立大鼠糖尿病模型,正常对照组注射等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,每周监测血糖。建模成功后8周处死2组大鼠,微型CT(micro-CT)扫描重建上颌骨,测量牙槽骨吸收和颌骨骨形态学参数值。无菌条件下分离2组大鼠下颌骨,获取颌骨BMSCs。CCK-8法检测细胞增殖能力,碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色和活性测定检测2组细胞ALP表达,茜素红染色和定量分析检测2组细胞钙结节形成能力,实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Runx2和OCN的mRNA表达,western blot检测NF-κB p65核蛋白表达。结果:与正常对照组相比,糖尿病组大鼠牙槽骨吸收增加(P<0.05),颌骨骨体积分数(bone volume/total volume,BV/TV)降低(P<0.05),骨小梁数目(trabecular number,Tb.N)减少(P<0.05),骨小梁间隙(trabecular space,Tb.Sp)增加(P<0.05)。成功分离、培养糖尿病大鼠颌骨来源的BMSCs,与正常大鼠颌骨BMSCs相比,细胞增殖能力降低(P<0.05),ALP活性和钙结节形成减少(P<0.05),成骨相关基因Runx2和OCN mRNA表达下降(P<0.05),NF-κB p65核蛋白表达增多(P<0.05)。结论:糖尿病可影响大鼠颌骨结构,降低颌骨BMSCs成骨分化能力,机制可能与NF-κB信号通路激活相关。

TNF-α对牙周膜干细胞和颌骨骨髓间充质干细胞自噬水平的影响

目的:探讨肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)和颌骨骨髓间充质干细胞(jaw bone marrow mesenchymal stem cells,JBMMSCs)两种干细胞自噬水平的影响。方法:通过胰酶消化法体外分离培养PDLSCs/JBMMSCs,流式细胞仪及实时定量RT-PCR筛选短时间内不导致细胞凋亡的TNF-α的最大浓度,然后与PDLSCs/JBMMSCs共培养,Western blot检测不同时间点两种细胞自噬和凋亡的表达水平。结果:成功地筛选出TNF-α的最佳浓度为50 ng/m L。采用该浓度作用于PDLSCs/JBMMSCs,短期作用(24 h)可以激活细胞的自噬水平,凋亡水平下降;如果TNF-α持续作用,细胞的自噬水平反而下降,凋亡增加。结论:在一定的条件下,TNF-α可以激活PDLSCs/JBMMSCs的自噬水平,免于细胞发生凋亡。

糖基化终末产物对人牙周膜干细胞和骨髓间充质干细胞骨向分化能力影响的比较研究

目的:观察糖基化终末产物(AGEs)对人牙周膜干细胞(hPDLSCs)及人颌骨骨髓间充质干细胞(hBMMSCs)骨向分化能力的影响。方法:组织块法和有限稀释法克隆化培养hPDLSCs及hBMMSCs,流式细胞仪检测两种细胞表型分子表达,取第3代细胞分别在10μg/mL AGEs刺激下进行矿化诱导,于诱导的21 d,茜素红染色、十六烷基吡啶定量观察钙结节形成情况、诱导7 d,碱性磷酸酶染色观察ALP活性、实时定量聚合酶链反应(real time PCR)和Western blot检测成骨相关基因及蛋白表达情况。结果:流式细胞仪显示两种细胞均阳性表达CD44、CD146、stro-1、CD90。成骨诱导21 d后茜素红染色和定量分析显示,hPDLSCs AGEs组矿化能力低于对照组;而hBMMSCs AGEs组矿化能力高于对照组(P<0.05)。成骨诱导7 d后,ALP染色显示,两种细胞ALP活性变化趋势与茜素红定量分析相同;RT-PCR检测hPDLSCs中ALP、Runx-2、Col-1、Runx-2mRNA表达水平均低于对照组,而hBMMSCs中各基因均高于对照组(P<0.05)。Western blot检测显示,各组Runx-2蛋白表达趋势与RT-PCR结果趋势相同。结论:AGEs抑制hPDLSC的骨向分化,促进hBMMSC骨向分化。