小毛莨内酯对结核病人颗粒裂解肽基因表达的作用

目的 研究小毛莨内酯 (Ternatolide ,Tern)对健康成人 ,初诊未治、耐药肺结核病人及儿童结核患儿周围血淋巴细胞 (PBL)体外活化后颗粒裂解肽 (granulysin ,GLS)mRNA表达的作用 ,探索其抗结核菌的分子免疫学机理。方法 采用反转录聚合酶链反应半定量 (QC RT PCR)方法 ,测定不同剂量的Tern对以上 4组人群PBL颗粒裂解肽mRNA表达水平的影响。结果 当Tern在 10 0mg·L-1,2 0 0mg·L-1浓度时 ,均能诱导以上 4组人群体外活化的PBLGLSmRNA的表达 ,且各组诱导表达水平无显著差异。结论 Tern可能是通过提高CTL的效应分子GLSmRNA表达的水平 ,杀灭胞内致病菌MTB ,其诱导作用呈现剂量依赖性。

颗粒裂解肽G13结构域的表达及其对大肠杆菌活力的影响

目的构建携带颗粒裂解肽G13结构域的原核表达质粒,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达目的蛋白,并检测其对大肠杆菌活力的影响。方法人工合成G13结构域编码DNA序列,PCR扩增后,用T-A克隆法与pBAD/TOPOThioFusion表达载体连接。通过PCR鉴定及测序筛选阳性重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),经阿拉伯糖诱导表达,SDS-PAGE检测表达情况,同时监测诱导表达前后工程菌A600值的变化及菌液中的突变体。结果工程菌经诱导,表达出相对分子质量约15000的特异蛋白,表达量占菌体总蛋白的3%左右。随着外源蛋白的表达,菌液A600值下降,随后又缓慢上升。提取的质粒测序结果表明,其启动子的-35区和-10区均发生了突变,随着诱导时间的增加,突变细胞的比例不断增加。结论已成功构建了G13结构域原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出G13融合蛋白。该异源蛋白的表达导致工程菌的活力降低。

颗粒裂解肽G13结构域的重组表达及蛋白质结构预测

基因工程构建表达是获得抗菌肽的一种成本较低的方法,本实验人工合成G13结构域编码DNA序列,PCR扩增后,用T-A克隆法与pBAD/TOPO ThioFusion表达载体连接,通过PCR鉴定筛选出正确重组质粒,在大肠杆菌Top10中对目的蛋白进行表达,大肠杆菌工程菌经阿拉伯糖诱导后取样,用SDS-PAGE检测表达情况,采用生物信息学方法对表达蛋白的结构特征进行模拟分析。结果显示:目的蛋白在原核系统中实现了高效表达,表达量高达67%以上,主要以包涵体形式表达。蛋白结构预测结果显示,目的蛋白原有的α螺旋活性结构无改变,从而为抗菌肽高效生产提供了有效可靠的研究途径。

结核杆菌的克星——颗粒裂解肽

目的 介绍国外有关治疗结核病新药研究的进展。方法 综述国外文献。结果 颗粒裂解肽在细胞毒性淋巴细胞CTL和天然杀伤细胞NK激活晚期被诱导表达。颗粒裂解肽的基因编码 3种mRNA ( 5 19,5 2 0 ,5 2 2 ) ,两种肽 ( 90 0 0 ,15 0 0 0 ) ,15 0 0 0的经翻译后修饰为 90 0 0 ,含一个alpha helix和一个二硫键的 2 2氨基酸肽段为抗结核杆菌的结构域。天然颗粒裂解肽和重组颗粒裂解肽都具有广谱抗菌活性 ,尤其是能杀死结核杆菌。

人颗粒裂解肽片段在大肠杆菌中的表达

目的:建立颗粒裂解肽(NKG5)的原核表达载体系统,并在大肠杆菌中获得表达。方法:采用寡核苷酸合成、PCR扩增得到NKG5编码序列,克隆到pGEM-T载体上,经测序正确后,再切下编码序列连接到重组表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导重组工程菌表达,采用谷胱甘肽偶联的Sepharose4B纯化重组蛋白。结果:重组菌株可以表达GST-NKG5融合蛋白,用免疫印迹反应鉴定纯化的融合蛋白,在相对分子质量34000处有一条带。结论:获得了在大肠杆菌中低表达的颗粒裂解肽融合蛋白,为后续研究奠定了基础。

人颗粒裂解肽突变子在大肠埃希菌中的构建与表达研究

目的构建NKG5突变基因的原核表达载体并进行表达研究。方法采用寡核苷酸合成的方法,拼接成为NKG5-Ser的编码序列,克隆到pGEMT载体上,测序正确后,再切下编码序列连接到质粒pGEX-4T-1中,重组表达载体转化大肠埃希菌BL21(DE3)pLysS,用IPTG诱导使融合蛋白高效表达。结果成功获得重组表达载体pGEX-4T-1-NKG5-Ser,转染大肠埃希菌BL21(DE3)pLysS,诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹反应均显示显示出相对分子量(Mr)为35 kD的蛋白条带,证明融合蛋白表达成功。结论获得了突变NKG5与GST的融合蛋白,为进一步的工作打下了基础。

颗粒裂解肽G13结构域在大肠杆菌中的高效融合表达

为高效表达颗粒裂解肽G13结构域并避免G13对宿主菌的毒性,将人工合成的编码G13的基因片段,PCR扩增后克隆于原核表达载体pThioHisA中,构建了重组表达载体pThioHisA-G13,将其转化于大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达融合蛋白Trx-G13,表达产物以包涵体的形式存在,其表达量约占细菌总蛋白的58%。包涵体蛋白经8 mol/L尿素溶解后,再经CNBr切割,阳离子交换层析,得到纯化的重组G13结构域。琼脂糖扩散法检测表明重组G13结构域多肽具有抗菌活性。

猫爪草对肺结核患者外周血淋巴细胞颗粒裂解肽表达及其T淋巴细胞杀菌能力的影响

目的研究猫爪草对肺结核患者外周血淋巴细胞颗粒裂解肽表达的影响及其对肺结核患者机体细胞毒性T淋巴细胞杀菌能力的影响。方法四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测猫爪草对外周血淋巴细胞作用的最适浓度;Real-time PCR方法检测最适剂量的猫爪草对结核病人外周血淋巴细胞颗粒裂解肽mRNA表达水平的影响。结果 MTT结果显示,当猫爪草的作用浓度为100mg·L^(-1)时,有很明显的诱导作用,能诱导结核菌表达,外周血淋巴细胞颗粒裂解肽(GLS)的表达升高,进而感染结核病人体内的结核菌;当药物浓度浓度为200 mg·L^(-1)时能高效诱导结核休眠菌活化,外周血淋巴细胞GLS mRNA的表达持续升高,对结核菌的杀伤能力更强。结论猫爪草可能通过提高颗粒裂解肽的表达,增强机体对致病菌的杀伤作用,从而达到治疗效果。

小毛莨内酯对结核休眠菌感染病人GLS mRNA表达的影响

目的 研究小毛莨内酯抗人体结核休眠菌感染的分子免疫学机理。方法 采用PCR方法检测结核病人PBLs中结核菌 16kDα 晶状体同源蛋白DNA阳性的 5 6例患者为本研究对象 ;采用反转录聚合酶链反应半定量 (QC RT PCR)方法 ,测定不同剂量的Tern .对以上病人PBL颗粒裂解肽mRNA表达水平的影响。结果 当Tern .在 10 0mg L ,2 0 0mg L浓度时 ,能诱导结核休眠菌感染病人体外活化的PBLGLSmRNA的表达。结论 Tern .可能通过促进颗粒裂解肽mRNA的表达 ,增强机体CTL杀菌能力 ,达到抗结核休眠菌的作用。