支原体菌落形成单位与颜色改变单位定量关系研究

目的研究支原体菌落形成单位(cfu)和颜色改变单位(ccu)2种微生物定量方法计数支原体的定量关系。方法用A8培养基肉汤、支原体培养基肉汤及SP4培养基肉汤五倍梯度对应稀释ATCC33175、ATCC23114及ATCC29342冻干粉,再对应接种A8琼脂培养基、支原体琼脂培养基及SP4琼脂培养基,培养后按ccu和cfu方法对支原体计数。结果cfu计量3株支原体标准差都比ccu计量大,计量数值也都比ccu计量大,ccu和cfu计量ATCC33175差异无统计学意义(P>0.05),而二者计量ATCC23114和ATCC29342差异有统计学意义(P<0.05)。结论采用五倍梯度稀释的ccu计量,ATCC33175无差异,其他脲原体是否有同样结果仍需要进一步研究,通过降低梯度稀释倍数是否可以消除2种方法计量ATCC23114和ATCC29342产生的显著性差异也需要进一步研究。

猪肺炎支原体SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速高效的猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)检测方法,根据NCBI公布的Mhp保守序列设计4对特异性引物,依据4对引物的荧光定量PCR检测结果及拟合曲线进行相关性分析,筛选出最佳引物(SX4),建立了Mhp SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法。该方法可特异性检测Mhp,对猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、副猪嗜血杆菌4型及链球菌2型等病原均无特异性扩增;最佳引物SX4检测的灵敏度可达4.9×10^(1) copies/μL,组内和组间变异系数均小于2%。该方法可稳定检测出工艺生产抗原和市售疫苗中的Mhp菌量。试验表明,本研究成功建立了Mhp SYBR Green Ⅰ实时荧光定量检测方法,其特异性强、灵敏度高、重复性好,可用于Mhp疫苗抗原生产和临床疫苗中的Mhp菌量检测。

肺炎支原体培养镜下观察与其CCU相关性分析

建立肺炎支原体镜下观察分级标准,并与测定的CCU和实时荧光定量PCR测定结果进行关联,估算CCU。通过镜下观察肺炎支原体培养浓度和分布范围,确定其分级;采用CCU目测法和实时荧光定量PCR法测定肺炎支原体培养结果,使用等级相关分析方法 Kendall法及Spearman法进行相关性分析。结果显示,肺炎支原体镜下观察标准分为四级,与CCU及实时荧光定量PCR测定值进行关联,呈正相关。镜下观察肺炎支原体的分级越高,则测定的CCU与实时荧光定量PCR值就越高。同时发现菌液稀释104倍数时,各组实时荧光定量PCR测定值均较理想,可作为肺炎支原体培养的最佳培养稀释倍数。结果表明,在肺炎支原体培养过程中,可通过镜下观察估算其CCU,较为简便实用。

猪肺炎支原体生长培养基的筛选

为了解猪肺炎支原体的培养特性,筛选出肺炎支原体生长的最适培养基,试验采用颜色改变单位(CCU)计数法和PCR方法对猪肺炎支原体在4种常用培养基及改良KM2培养基中生长情况进行了检测与比较。结果显示:改良的KM2培养基为最适培养基,10天时颜色改变单位可达108CCU/mL。