基于pyrF的乳酸乳球菌食品级表达载体的构建

基于pyrF筛选标记和来源于乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)的基因组DNA为表达元件,构建L.lactis食品级表达载体,用于食品和药用多肽的表达和生产。首先,利用NZ3900 pyrF基因列构建同源重组突变盒,构建NZ3900 ΔpyrF突变株;然后,分别以来源于L.lactis的repA和repC基因为复制元件、pyrF基因为筛选标记、P_(32)和P_(8)为启动子、以及Tusp_(45)和TpepN为终止子,构建食品级表达质粒pLD;最后以绿色荧光蛋白ZsGreen为报告基因,验证ZsGreen在NZ3900 ΔpyrF突变株的表达及pLD-ZsG的遗传稳定性。实验结果表明,原养型ZsGreen阳性转化子可在普通Elliker培养基中正常生长,在荧光显微镜下观察到明显的绿色荧光信号;此外,PCR和Western blotting也证实ZsGreen能在NZ3900中表达且能稳定传代至30代,说明pLD食品级表达载体构建成功且使得外源蛋白在L.lactis中稳定表达。综上所述,基于pyrF营养缺陷型标记构建的L.lactis食品级表达载体的方法切实可行,可为推动L.lactis在食品和药用多肽生产中的应用提供研究基础。

人铜锌超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的食品级表达

以lacF基因为食品级选择标记 ,构建了乳酸乳球菌食品级基因表达系统 ,并进而实现了人铜锌超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的食品级表达。首先构建了含有lacF基因两侧同源DNA序列 (0 .5kb)的整合型质粒pUCEmDE ,通过pUCEmDE与乳酸乳球菌MG52 67染色体上单拷贝的乳糖操纵子之间的同源双交换 ,构建了lacF基因缺失突变的食品级受体菌WZ1 0 3 (Lac-) ,并经PCR及Lac表型检测所验证。然后构建了互补质粒pMG36eF ,其lacF基因的表达受组成型的强启动子P32 的控制。将其电转化导入WZ1 0 3后 ,Lac+表型得到恢复 ,表明WZ1 0 3中lacF基因的功能可被互补质粒pMG36eF上的lacF基因互补。随后 ,以互补质粒pMG36eF为基础 ,构建了不含任何抗生素抗性选择标记的人铜锌超氧化物歧化酶基因的食品级表达质粒pWZ1 0 4。通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和SOD活性凝胶染色分析 ,检测到WZ1 0 3(pWZ1 0 4 )中Cu ZnSOD的表达 ,并且具有生物活性.

乳酸菌中幽门螺杆菌ureB基因的食品级表达与优化

目的:以乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)为宿主菌构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylo-ri)尿素酶B(UreB)的食品级表达系统。方法:从重组质粒pMD19-T-ureB上酶切得到ureB基因片段,与含有筛选标记lacF基因的L.lactis表达载体pNZ8149经双酶切后定向连接,应用PCR、酶切和测序的方法鉴定重组子。重组菌用乳联菌肽诱导表达,用正交表实验进行表达条件的优化,通过SDS-PAGE和Western blot对重组蛋白进行鉴定。结果:重组菌NZ3900/pNZ8149-ureB经鉴定与预期相符。优化结果显示在菌体培养到D600nm为0.40左右时加入终浓度为25μg/L的乳联菌肽诱导5h产量最高,通过Western blot能检测到UreB的表达。结论:构建了ureB基因食品级表达系统,并得到了表达的最优条件。

乳酸杆菌食品级表达系统的构建与鉴定

以LacF为选择标记,构建了乳杆菌食品级表达系统.首先克隆了Latobacillus caseiATCC393乳糖操作子LacF和LacG基因片段,将LacF克隆至载体pRV300上后,利用T4DNA聚合酶消除了LacF片段的SphⅠ位点,构建了LacF基因编码区移码突变的质粒pRV△lacf,随后将LacG片段与质粒pRV△lacf连接后获得了质粒pRVg△lacf.同时将没有移码突变的LacF和LacG基因片段克隆至载体pRV300上,构建了整合型载体pRVgf.将质粒pRVg△lacf电导入L.caseiATCC393中,筛选到不能在乳糖平板上生长的突变菌株.经PCR分析表明,该菌株的LacF基因被移码突变基因Lac△F所取代,命名为L.caseiMBL25(LacF-).为了鉴定此系统的可行性,将豆豉溶栓酶基因成熟肽编码片段插入到整合型载体pRVgf中,成功构建了质粒pRVgf-badfe,将其导入L.caseiMBL25(LacF-)后,筛选LacF+菌株.PCR分析结果显示,豆豉溶栓酶基因已经整合到L.casei染色体中并且表型已经得到恢复.表明MBL25(LacF-)中LacF基因的功能能被pRVgf-badfe上的LacF基因互补.经0.5%乳糖过夜诱导后,SDS-PAGE电泳显示成功表达了相对分子质量(Mr)28×103大小的特异蛋白.

产谷氨酸脱羧酶重组枯草芽孢杆菌的构建与食品级表达

谷氨酸脱羧酶(GAD)是生物合成γ-氨基丁酸(GABA)的关键酶。本研究构建了4株无抗标记的重组枯草芽孢杆菌,首次实现了乳酸乳球菌(Lactococcus lactis ssp.lactis IL 1403)来源的谷氨酸脱羧酶基因在枯草芽孢杆菌中的食品级表达。通过比较4株重组枯草芽孢杆菌的生长曲线和发酵酶活曲线,筛选出产酶效率最高的重组菌株B.subtilis WB600/pUB-P43-gadB(opt)-dal,该重组菌在初始发酵培养基中发酵42 h后发酵酶活可达4.1 U/mL。通过调整培养基成分,重组菌B.subtilis WB600/pUB-P43-gadB(opt)-dal的发酵酶活最高达到7.4 U/mL,与初始相比酶活提高了79%,是目前已报道重组枯草芽孢杆菌产谷氨酸脱羧酶酶活的最高水平。

乳酸菌食品级表达载体的研究与应用

乳酸菌是能够发酵糖类产生大量有机酸的革兰氏阳性菌的通称,在发酵食品中有着悠久的应用历史。乳酸菌通常被认为是安全菌株,这些微生物的基因工程操作在食品、医学等方面具有广阔的应用前景。表达载体是基因工程中常用的工具之一,大多数乳酸菌的表达载体通常以抗生素抗性基因作为选择标记,然而抗性基因具有潜在的转移性,因此需要开发食品级表达载体。食品级表达载体不含有抗生素的抗性基因,仅包含来自同源宿主或通常被认为是安全生物的DNA。本文介绍了乳酸菌食品级表达载体的构成及其常用宿主,同时对乳酸菌食品级表达载体的应用进行了归纳总结。

亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌WU14亚硝酸盐还原酶的食品级高效诱导表达及其酶学性质研究

【目的】研究亚硝酸盐胁迫下植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)WU14亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase,Nir S)的作用机制,为发酵食品中应用乳酸菌纯种培养技术降解亚硝酸盐奠定基础。【方法】在37℃培养条件下,测定含0.02%—0.16%Na NO2的MRS培养液中L.plantarum WU14 24 h的生长密度、p H及Na NO2降解量。通过PCR扩增和TA克隆得到Nir S,并克隆到乳酸乳球菌食品级细胞内高效诱导表达载体p RNA48中,获得重组菌L.lactis NZ9000/p RNA48-Nir S。重组菌经30 ng·m L-1 nisin诱导后,经SDS-PAGE和盐酸萘乙二胺法分析目的蛋白的表达情况及Nir S酶活。通过生物信息学软件预测分析Nir S编码的蛋白质二三级结构、跨膜结构及疏水性。【结果】L.plantarum WU14能够在Na NO2浓度小于0.12%的MRS培养基中生长并降解一部分Na NO2,在0.10%Na NO2培养液中发酵24 h后降解量达到最大,为56.34μg·m L-1,Nir S酶活达2 347.5 U·m L-1。Nir S编码的蛋白质是一种以α-螺旋和无规则卷曲为主,不存在信号肽和跨膜结构的亲水蛋白。Nir S可在L.lactis NZ9000中高效表达,该重组菌能够在Na NO2浓度低于0.10%的GM17培养基中生长并降解一部分Na NO2,在含0.04%Na NO2的培养液中亚硝酸盐降解量达到最大,为22.21 mg·m L-1,Nir S酶活为925.41 U·m L-1。【结论】L.plantarum WU14的Nir S能够降解高浓度的亚硝酸盐,并且经食品级异源表达的Nir S具有较高的酶活力。本研究为探索研究亚硝酸盐降解的机理,建立发酵食品中亚硝酸盐降解的可控发酵体系提供了参考。

食品级高产亮氨酸氨肽酶重组Bacillus subtilis的构建和发酵优化

为解决枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在发酵产亮氨酸氨肽酶(leucine aminopeptidase,LAP)需额外添加抗生素的问题,该研究构建了1株食品级产LAP重组B.subtilis。首先通过Cre/lox系统敲除B.subtilis 168基因组中D-丙氨酸消旋酶基因(dal)得到缺陷型菌株BS168(dal)^-。其次使用高斯组装的方法构建以dal作为标记基因的质粒pMA5-lap-dal(Amp^R,Ori)-并转化至BS168(dal)^-中得到食品级重组菌BS168(dal)-/p MA5-lap-dal(Amp^R,Ori)^-。该工程菌发酵产LAP无需添加抗生素且不含抗性基因。对该菌株进行5 L发酵罐条件优化,在转速300 r/min、温度33℃、p H 7.0、分阶段补料的条件下,酶活最高达到302 U/m L。结果表明,构建的食品级重组B.subtilis产LAP具有潜在的工业应用前景。

南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)基因在乳酸乳球菌MG1363中的整合及表达

根据南极假丝酵母脂肪酶B(CALB)的基因序列将CALB基因进行TA克隆、酶切鉴定及测序后,亚克隆至大肠杆菌-乳酸乳球菌穿梭表达载体pMG36e-NisI中,构建重组表达载体pMG36e-NisI-CALB。设计特异性引物P3和P4,对重组质粒pMG36e-NisI-CALB进行红霉素抗性基因的敲除,以构建食品级表达载体pMG36N-CALB,后再将两种重组质粒分别电转化入乳酸乳球菌MG1363,以Nisin为选择压力,考察CALB在MG1363中的表达情况。结果显示,成功构建了表达载体pMG36e-NisI-CALB及pMG36N-CALB,两株重组菌在含有20 IU Nisin/mL的培养基中均生长情况良好,遗传性能稳定,且经水解圈鉴定,CALB能够进行活性表达。进一步研究发现,CALB基因整合到乳酸乳球菌MG1363染色体中。

大豆锰超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的分泌表达

为使大豆锰超氧化物歧化酶(Mn superoxide dismutase,Mn SOD)在乳酸乳球菌中高效表达,将克隆的Mn SOD基因开放阅读框序列分别重组到质粒p NZ8149和经改造的质粒p NZS上,表达载体p NZ-SOD和分泌表达载体p NZS-SOD,将两者分别以电穿孔法转化乳酸乳球菌L.lactis NZ3900,经Elliker琼脂板筛选、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)、酶切鉴定正确后,获得的两重组菌株加入Nisin进行诱导表达,对L.lactis NZ3900/p NZ-SOD和L.lactis NZ3900/p NZS-SOD的表达产物进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和酶活性对比分析。结果显示:L.lactis NZ3900/p NZS-SOD菌株表达SOD总活性约是L.lactis NZ3900/p NZ-SOD菌株的1.6倍,是L.lactis NZ3900/p NZ8149的13.5倍,且可将表达的约2/3的SOD分泌到胞外,表明经改造的乳酸菌分泌表达系统L.lactis NZ3900/p NZS能够分泌表达SOD,并增强SOD的表达。

脲酶基因挖掘及其在枯草芽孢杆菌中的重组表达

氨基甲酸乙酯(ethyl carbamate,简称EC)是一种存在于黄酒中的潜在致癌物,酶法降解EC及其前体物质尿素因此备受关注。该研究通过基因挖掘获得了解淀粉芽孢杆菌IT-45的脲酶(Ba-urease)基因并在食品级系统枯草芽孢杆菌中实现了表达与应用。通过密码子优化、核糖体结合位点优化重构脲酶基因簇后,酶活力从6.85 U/mL提升至9.01 U/mL;通过调整基因ureC的位置,脲酶活力进一步提升至10.15 U/mL。研究发现,重组脲酶的最适反应温度为37℃;最适反应pH范围为6.5~7.0,为中性脲酶。摇瓶发酵的最佳培养条件为:TB培养基、接种体积分数5%、诱导温度28℃、Ni^(2+)添加量4 mmol/L。在最佳发酵条件下,酶活力达到12.5 U/mL,在酶法降解黄酒中的尿素具有应用前景。

乳酸菌基因表达载体及其应用研究进展

近年来随着乳酸菌的功能特性和应用研究的深入,利用分子手段研究乳酸菌的功能基因已经成为最新研究热点。研究者构建众多不同特性的基因表达载体,本文从载体使用的安全性角度对已经报道的载体进行总结,并介绍各类基因表达载体在发酵产胞外多糖、酶制剂、疫苗制备等方面的应用。

高酶活性β-甘露聚糖酶定向进化及其用于制备甘露寡糖

为了提高β-甘露聚糖酶的活性,采用易错PCR将来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)KD-1的β-甘露聚糖酶基因manBl进行定向进化,并在枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中进行表达,以筛选酶活性提高的β-甘露聚糖酶突变体。筛选得到的突变体ManBl(I91N/L211I),其比酶活性为15554.7 U/mg,是野生型ManBl的4.1倍,食品级表达的胞外酶产量达17601.3U/mL。分子动力学和分子对接结果表明,β-甘露聚糖酶在2个位点(I91N/L211I)的突变,导致蛋白催化口袋柔性增加,与底物结合能力提高,进而提高了酶的催化效率。β-甘露聚糖酶ManBl(I91N/L211I)水解魔芋胶产物主要由甘露六糖、甘露三糖和甘露二糖组成。报道的I91N/L211I 2个位点联合突变能够提高β-甘露聚糖酶活性;ManBl(I91N/L211I)食品级表达为该酶的绿色安全应用奠定了基础。