EZH2蛋白在食管上皮永生化细胞系和恶性转化细胞系中的表达

目的研究EZH2蛋白在食管上皮永生化细胞系(SHEE)和恶性转化细胞系(SHEEC)中的表达。方法采用免疫细胞化学染色、免疫印迹分析和流式细胞术检测两种细胞系EZH2蛋白的表达。结果两种细胞EZH2蛋白染色均呈阳性,阳性反应定位于细胞核,部分细胞胞浆也有阳性着色。免疫印迹分析表明SHEEC细胞和SHEE细胞的总蛋白、核蛋白在分子质量约90ku的位置均出现特异性印迹条带。SHEE细胞中EZH2蛋白的表达强于SHEEC细胞(P<0.05)。流式细胞术显示EZH2蛋白在两种细胞中均有表达,两者的平均荧光强度无明显差别;阳性细胞率均较高,其中SHEE细胞阳性率高于SHEEC细胞。结论EZH2蛋白在SHEE细胞和SHEEC细胞中高表达可能参与了它们的恶性改变;而EZH2蛋白在两种细胞系中的差异表达可能与细胞的分化程度及来源于胚胎食管上皮细胞相关。

食管上皮永生化细胞系研究进展

建立合适的模型系统是研究食管癌癌变过程的重要课题.食管永生化细胞株较难建立,他既具有正常细胞的特征,而且已经处于持续增生状态,易于转化,对研究食管癌变过程是一种良好工具模型.本文就近年来有关食管上皮永生化细胞的研究进展作一综述.

细胞角蛋白在食管永生化上皮细胞和恶性转化细胞系的表达

目的:研究细胞角蛋白(cytokeratin,CK)在食管永生化上皮细胞株SHEE和由SHEE恶性转化而来的细胞株SHEEmt之间的差异表达。方法:采用免疫细胞化学染色和免疫印迹的方法,观察SHEE细胞和SHEEmt细胞中CK的表达。结果:免疫细胞化学染色显示两种细胞均呈CK染色阳性,阳性反应位于胞浆;SHEE细胞染色弱阳性,SHEEmt细胞染色中等强度阳性。免疫印迹分析在两种细胞中抗角蛋白抗体均与分子量52.5ku、46ku和45ku的抗原同时发生反应;但SHEEmt细胞中的3条阳性反应带均强于SHEE细胞。结论:CK阳性表达支持两种细胞来源于非角化型或胎儿型鳞状上皮;随着永生化细胞转化为恶性细胞,某些角蛋白表达上调,可能与细胞恶性转化后的分化程度相关。

人乳头状瘤病毒诱导人胚食管上皮永生化细胞恶性转化

为了证实HPV18E6E7基因诱导的人胚食管上皮永生化细胞 (SHEE) 6 1代 (SHEE6 1)部份细胞 (SHEE6 1A)已经恶性转化 ,以寻找监控细胞早期恶性转化的方法。对培养的SHEE第 10代 (SHEE10 )和 6 1代 (SHEE6 1)细胞 ,用光学显微镜和电子显微镜观察细胞形态及生长形式 ;用流式细胞仪分析细胞周期 ;用染色体G带核型分析和间期核染色体 1、7、8号着丝粒探针荧光原位杂交 (FISH)检测细胞染色体改变 ;用增殖优势克隆优选法选出生长快的细胞群体 ,接种裸小鼠和SCID小鼠。结果 :光学显微镜下见SHEE6 1细胞大小不等 ,重叠生长 ;电子显微镜下见细胞核多型性和核仁增大等增殖表型 ;流式细胞仪检测 ,SHEE6 1增殖指数和DNA >4n细胞高于SHEE10 ;SHEE6 1细胞染色体众数出现 5 7～ 6 0、6 3～ 6 5两亚群 ,1、7、9、13、17等染色体出现较多 3体、4体或 5体 ;FISH间期核 1、7号着丝粒数增多 ;SHEE6 1克隆优选的细胞SHEE6 1A接种SCID小鼠成瘤。这表明 :SHEE6 1细胞形态及生长特性有了改变 ,接触抑制减弱 ,高倍体和不整倍体细胞增多 ,染色体数目明显改变 ,SHEE6 1A接种SCID小鼠产生浸润性肿瘤 ,可以判定SHEE6 1部份细胞已恶性转化。用克隆优选法筛选和染色体检测可以监控永生化细胞早期恶性转化。

人乳头状瘤病毒诱导食管上皮永生化细胞的双相分化

研究中期永生化食管上皮细胞的表型、细胞遗传学和部份基因的改变 ,以阐明癌前病变的特征。SHEE是该院用人乳头状瘤病毒HPV18E6E7诱导的永生化上皮 ,传至 6 1代已开始有少量细胞恶性转化。对永生化中期 31代培养细胞用相差显微镜检查细胞形态改变和细胞生长状态 (细胞接触抑制和锚定生长 ) ;流式细胞仪检测细胞周期 ;做染色体众数分析 ;多重PCR检查c-myc、p5 3、bcl- 2和ras等基因。免疫组化检查细胞角蛋白和鬼臼毒素荧光标记检查肌动蛋白F(F -actin)。软琼脂培养的集落细胞接种SCID小鼠检查成瘤性。Westernblot方法检测细胞内HPVE6表达蛋白。结果 :培养细胞有两种不同分化形态 ,分化差的基底细胞和分化好的鳞状上皮 ;前者角蛋白和F -actin极少 ,后者含量丰富 ;细胞接触抑制和锚锭生长特性减弱。分析 10 0个细胞染色体众数分二干系 ,5 6条 (占 30 % )和 6 1条 (占 2 4% )染色体 ,核型分析属于超二倍体 ,亚三倍体。多重PCR检查 :c -myc、p5 3基因上调 ,bcl- 2和ras基因阳性。用优选生长在软琼脂上的克隆细胞接种SCID小鼠 ,未成瘤 ;HPV18E6表达蛋白阳性。以HPV18E6E7诱导的食管永生化上皮 31代细胞形态出现了双向分化 ,根据其形态表型 ,双染色体众数的细胞遗传学改变和某些癌基因上调等特性 。

人子宫内膜异位症异位腺上皮永生化细胞系的建立

目的:建立人子宫内膜异位症(EMs)的异位腺上皮永生化细胞系,为进一步深入研究EMs奠定基础。方法:取人EMs异位病灶组织进行原代培养,用质粒PCD2SV40T转染原代细胞,G418筛选14天后获得抗性克隆。将抗性克隆传代培养,用免疫细胞化学、RT-PCR、细胞计数、核型分析及裸鼠成瘤实验等对细胞系进行鉴定。结果:建立了一株传代超过50代的永生化细胞系,命名为hEM5B2。该细胞系具有腺上皮细胞形态,细胞角蛋白与波形蛋白阳性,抗成纤维细胞抗体阴性,雌激素受体α和β亚型(ER-α,ER-β)及孕激素受体(PR)阳性,细胞倍增时间64.8h。核型分析显示,染色体众数为78～123,为多倍体核型;观察1个月裸鼠成瘤实验显示未成瘤。结论:hEM5B2细胞系是一株人EMs异位腺上皮永生化细胞系,可作为细胞模型用于EMs的体外实验研究。

食管细胞系和癌组织中分化抑制因子Id-1mRNA的表达

目的:探讨分化抑制因子Id-1基因在食管癌组织和食管癌细胞系中的表达状况。方法:采用RT-PCR方法检测食管癌细胞系(EC109、EC1、EC18)、食管永生化上皮细胞系(NECA6-E6E7和NECA6-E6E7-hTERT)及20例食管癌及其配对癌旁正常组织中Id-1mRNA基因的表达状况。结果:EC109、EC1、EC18、NECA6-E6E7和NECA6-E6E7-hTERT均出现Id-1mRNA的表达。正常食管上皮中未见其表达,癌旁组织中Id-1mRNA阳性表达率为35%(7/20),癌组织中为65%(13/20),有升高趋势,但差异无统计学意义(χ2=3.6,P>0.05)。结论:Id-1基因可能参与了食管癌的癌变过程。

新发现1例人卵巢上皮癌组织移植裸鼠形成的“端着丝粒染色体”恶性细胞系

目的按照常用肿瘤细胞建系方法,以人卵巢上皮癌组织移植免疫缺陷小鼠,通过原代培养建立永生化细胞系,为人体肿瘤的研究提供体外研究模型。方法将1例卵巢浆液性乳头状癌IIIcG3患者手术切除的肿瘤组织接种裸鼠皮下成瘤,通过体外原代培养,建立1株悬浮生长的细胞系。通过光学显微镜、电子显微镜、生长曲线测定、染色体分析、克隆形成实验、双层软琼脂培养、裸鼠接种等,对其生物学特性进行研究。结果该细胞系已传至100代以上,命名为WSZ。其生物学特性为:形态学观察细胞呈悬浮球形生长状态;细胞生长增殖旺盛,对数期细胞群体倍增时间约15.8h;染色体为16～135条,以68和69条染色体为多见,染色体分析显示,基本全部为端着丝粒染色体;细胞克隆形成率为89.3%,具有软琼脂集落形成能力;异种移植实验表明106细胞在裸鼠皮下可成瘤,而100个细胞接种非肥胖型糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠即可形成皮下肿瘤。结论 WSZ能够在体外长期生长和稳定传代,WSZ是一高度恶性的细胞系。

PDT杀伤人永生化食管上皮细胞系SHEE和其癌变细胞系SHEEC的机制研究

目的：探讨PDT光动力杀伤食管肿瘤细胞的主要机制。 方法：将贴壁人食管癌细胞系SHEEC及其人永生化食管上皮细胞系SHEE分别分为实验组和对照组,实验组将M199完全培养液更换为不含血清的光敏剂Photofrin-Ⅱ溶液,

人永生化食管上皮细胞恶性转化的验证

目的 检查永生化人胚食管上皮细胞系 (SHEE)的恶性表型、成瘤性和侵袭力 ,证实此细胞系传至 85代 (SHEE85 )已完全恶性转化。方法 培养的SHEE85细胞用光镜和电镜观察细胞形态 ;以流式细胞仪检查细胞周期 ;行细胞软琼脂培养 ;以裸小鼠和SCID小鼠接种检测其成瘤性 ;以细胞培养于羊膜的体外方法和移植至SCID小鼠腹腔的体内方法测定其侵袭力。结果 SHEE85在光镜下细胞生长拥挤 ,大小不一 ;电镜下见细胞呈增殖状态。DNA组方图统计细胞增殖指数为 4 7% ,高倍体细胞 12 %。软琼脂培养多细胞大集落形成率 4 %。接种的 4只裸小鼠和 4只SCID小鼠皆成瘤。结论 SHEE85已完全恶性转化 ,并且有较强侵袭力。

Toll样受体在人眼角膜上皮和永生化人角膜上皮细胞系的表达及功能研究

目的探讨Toll样受体(TLR)1～9在人眼角膜上皮和上皮细胞系的表达及其功能性。方法以健康人外周血单个核细胞(PBMC)为阳性对照,收集20例健康青年人角膜上皮标本和培养永生化人角膜上皮细胞系(THCE)细胞,用半定量反转录聚合酶链反应检测TLR1～9mRNA表达;Western印迹检测TLR2、4的蛋白质表达;TLR3和TLR4的配体对THCE刺激后酶联免疫检测分泌IL8的变化,结合抗体封闭实验,研究角膜上皮TLR的功能性。结果与PBMC比较,人角膜上皮强表达TLR1、2、3、5、6、9,弱表达TLR8,微弱表达TLR4;20例角膜上皮标本中发现1例TLR3、4、6、8阴性表达,1例TLR5微弱表达;人角膜上皮在蛋白质水平表达TLR2、4;THCE细胞与人角膜上皮有相似的TLR表达谱;LPS和PolyI:C刺激THCE1、4、8h后IL8分泌增加,8h时分别达到对照组的10倍和7倍(均P<0.05),抗体封闭TLR4可以阻断LPS诱导的IL8分泌。结论人角膜上皮表达TLR1～9,但不同TLRs表达水平有差异。THCE是研究人角膜上皮TLR表达和功能的良好细胞系。

小鼠永生化乳腺上皮细胞系的建立

目的建立永生小鼠乳腺上皮细胞系,为探索BRCA2功能提供细胞实验材料。方法应用酶消化与差速离心方法,分离获得原代小鼠乳腺上皮细胞,并对上皮细胞培养条件进行了优化。通过慢病毒介导方法将人类端粒酶基因转导到小鼠原代乳腺上皮细胞中,并以潮霉素B进行筛选,获得小鼠乳腺上皮细胞永生化细胞系。结果细胞形态学观察和细胞角蛋白检测结果表明,获得的小鼠乳腺上皮细胞为形态均一的乳腺管腔上皮细胞。结论成功构建了小鼠乳腺上皮细胞系,并确保了该细胞系的稳定性,为今后在研究乳腺癌发生发展机制方面提供了细胞模型。

抑癌基因PTEN蛋白在食管癌中的表达

目的：了解抑癌基因PTEN／MMAC1／TEPl(以下简称PTEN)蛋白在食管癌组织及食管永生化细胞、食管癌细胞中的表达。方法：选用69例2002年我校附属二院食管癌分级存档标本，采用免疫组织化学染色法观察食管癌、正常食管粘膜PTEN蛋白水平的表达，另外采用间接免疫荧光法、流式细胞术观察食管上皮永生化细胞和食管癌109、8712细胞株中PTEN蛋白水平的表达。

茶多酚对人乳头瘤病毒16亚基因永生化人宫颈上皮细胞生长的影响

目的 探讨茶多酚对人乳头瘤病毒16(HPV16)亚基因永生化宫颈上皮细胞(H8细胞)生长的影响.方法 采用0(对照组)、6.25、12.5、25、50 mg/L茶多酚与H8细胞共孵育24、36、48 h后,CCK8法检测细胞增殖,孵育24h后流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期,荧光显微镜观察细胞凋亡形态.结果 不同浓度茶多酚孵育H8细胞24、36、48 h可抑制H8细胞的增殖,12.5 mg/L茶多酚可时间依赖性降低H8细胞的相对生长率.流式细胞仪检测结果示,0、6.25、12.5、25、50 mg/L茶多酚组细胞凋亡率分别为29.96%±0.70%、52.62%±0.62%、52.22%±0.72%、42.52%±0.90%、45.96%±2.11%,组间差异有统计学意义(F=272.00,P< 0.05),各浓度茶多酚组细胞凋亡率均显著高于对照组(均P< 0.05).荧光显微镜下可见茶多酚处理组H8细胞出现核固缩、核碎裂等典型凋亡形态学改变.各浓度组细胞G1、G2期细胞比例和细胞增殖指数差异均有统计学意义(P<0.05).与对照组相比,6.25、12.5、25 mg/L组G1期细胞比例增加(55.96%±0.72%、54.12%±3.20%、65.30%±1.51%,均P< 0.05),G2期细胞比例减少(3.17±1.82%、4.94±1.46%、4.65±4.26%,均P<0.05),增殖指数降低(0.44±0.01、0.46±0.02、0.36±0.01,均P<0.05).结论 茶多酚可抑制H8细胞增殖,诱导细胞凋亡,阻滞细胞周期.

鸭源新型鹅细小病毒的分离鉴定与VP1基因序列分析

为确定发病鸭场的致病原,掌握该致病原的遗传进化特征,研究从山东省某鸭场采集到1份短喙与矮小综合征(SBDS)疑似病例病料,采用永生化鹅胚上皮细胞系(GEEC)对病料进行病毒分离培养,观察细胞病变,测定分离毒株的血凝性、病毒滴度(TCID_(50))、对鸭胚的致病性,并进行VP1基因序列比对及相似性分析。结果显示:临床病料分离培养的病毒可引起GEEC出现细胞明显皱缩、聚集、折光性增强等典型细胞病变,表明分离到一株鸭源NGPV毒株,命名为SDHZ株,该病毒对1%鸡红细胞无凝集性,TCID_(50)高达10^(-6.25)/mL,鸭胚半数致死量(ELD_(50))为10^(-4.5)/mL,接种鸭胚死亡出现全身及肝脏出血、短喙、发育迟缓等典型症状,VP1基因序列与樱桃谷鸭中分离的新型鹅细小病毒(NGPV)相似性为95.3%~98.0%,与GPV经典毒株的相似性为89.3%~94.6%。表明该鸭场本次疫病病原为NGPV,为进一步研究NGPV致病机制及制定综合防控措施提供参考。

消化系及腹部疾病

9705633 胃肠疾病和水、电解质及输液[日]/朝仓均∥临床研究.-1995,72(7).-41～45 友谊医9705634 以一种重组 SV40腺病毒传病媒介使人食管上皮细胞永生化/Tohya H∥Br J Cancer.-1995,71(4).