DNA甲基化与食管癌的关系

肿瘤细胞普遍存在DNA甲基化模式的改变,DNA甲基化异常包括原癌基因低甲基化和抑癌基因高甲基化。近年来研究结果表明,在食管癌发生过程中同样存在相关抑癌基因启动子区甲基化导致的基因表达的紊乱。其中由DNA甲基转移酶(DNA methyltrans-ferase,DNMT)和去甲基化酶的活性改变导致的抑癌基因CpG岛超甲基化的研究,已成为食管癌发病机制研究中的热点之一。综述DNA甲基化的特点及其抑制基因转录和表达的分子生物学机制;DNA异常甲基化与食管癌发生发展的关系;食管癌相关肿瘤抑制基因的甲基化谱构成了食管癌独特的表遗传学标志;目前常用的甲基化检测手段及各方法的优缺点;DNA甲基化和去甲基化研究的展望及所需要解决的的问题等。

MTHFR基因1298A→C多态与新疆哈萨克族食管癌风险关系的研究

目的:探讨亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因1298A→C多态及其和生活习惯相互作用与新疆哈萨克族食管癌风险的关系。方法:收集经组织病理学确诊的哈萨克族食管鳞癌新发病例88例外周血液标本,提取DNA;72名健康哈萨克族人群作为对照,同时调查每个研究对象的吸烟、饮酒情况。用PCR-RFLP技术检测研究对象的MTHFR1298A→C基因多态性。结果:病例组MTHFR1298AA、AC和CC基因型分别为63.64%、34.09%和2.27%,与对照组的72.22%、27.78%和0相比差异无统计学意义,χ2MH=2.57,P=0.276。MTHFR1298AA、MTHFR1298AC基因型与哈萨克族食管癌的发生无显著相关性,P>0.05。病例组与对照组1298C等位基因频率分别为0.19和0.14,两组间差异无统计学意义,P>0.05。与携带MTH-FR1298AA基因型的不吸烟者相比,携带MTH-FR1298C等位基因且有吸烟习惯者的性别、年龄以及饮酒习惯调整OR值为2.353(95%CI为0.892～6.210)。与携带MTHFR1298AA基因型的不饮酒或不常饮酒者相比,携带MTHFR1298C等位基因并伴有经常饮酒的习惯者发生食管癌的危险性也显著增高,其性别、年龄以及饮酒习惯调整OR值为1.860(95%CI为0.585～5.915)。结论:叶酸摄入不足是新疆哈萨克族食管癌的危险因素;MTHFR1298AC和CC基因型对吸烟、饮酒习惯增加食管癌发生风险作用有放大效应。

食管癌淋巴结转移相关基因筛选的研究

目的:利用cDNA microarray比较食管癌淋巴结转移与非转移患者的基因表达谱,旨在筛选食管癌淋巴转移相关基因,加深对其转移机制的了解。方法:按一步法抽提35例原发性食管癌和相应正常食管黏膜上皮细胞的总RNA并纯化mRNA;应用T7RNA聚合酶进行RNA扩增成cRNA,将等量的食管癌细胞和对应正常细胞cRNA分别逆转录合成荧光分子掺入的cDNA一链做探针,混合后杂交于癌基因芯片。严格洗片后杂交信号经扫描等处理并用生物信息学对检测结果进行分析。同时应用实时荧光定量RT-PCR进行验证试验。结果:58条基因在食管癌淋巴结转移与非转移患者之间差异有统计学意义(P<0.05),其中上调表达基因28条,主要集中于细胞黏附分子和细胞受体,下调基因30条,主要为细胞周期调节和细胞间信号分子。实时荧光定量RT-PCR验证其中6个基因,结果一致。结论:高通量基因芯片技术筛选出大量食管癌淋巴结转移相关基因,对这些基因功能的验证有助于找到淋巴转移的关键基因或通路,为预防和控制其转移提供了新的思路与线索。

人源性食管鳞癌cDNA文库的构建及鉴定

目的:构建人源性食管鳞癌cDNA噬菌体表达文库。方法:从人食管鳞癌组织中提取总RNA并分离纯化mRNA,用RT-PCR合成cDNA单链,LD-PCR扩增双链cDNA,除去<500bp的小片段,与载体λTriplEx2噬菌体左右臂连接,经体外包装即构成全长cD-NA噬菌体表达文库。转化E.coliXL1-Blue感受态细胞,测定文库的滴度,确定文库的容量大小,用蓝白筛选测定文库的重组率,PCR鉴定cDNA插入片段的大小。结果:构建的人源性食管鳞癌cDNA噬菌体表达文库滴度为1.64×106pfu/mL,重组率为98.6%,cDNA插入片段的大小为0.7～2.5kb,平均长约1.5kb。结论:成功构建1个人源性食管鳞癌cDNA噬菌体表达文库,适合于大批量筛选cDNA克隆的食管鳞癌肿瘤抗原基因。

食管癌染色体畸变及其与临床病理参数相关性研究

目的应用荧光原位杂交技术检测食管鳞状细胞癌染色体畸变情况,并分析其与临床病理参数相关性,探讨应用探针组合辅助诊断食管鳞状细胞癌的可行性。方法用染色体3、4、8、9、10、11、17、20号和Y着丝粒探针,与152例食管鳞状细胞癌细胞间期核进行荧光原位杂交,分析染色体畸变情况及其与临床病理参数的关系,统计染色体畸变组合检测食管鳞状细胞癌的阳性率。结果3、4、8、9、10、11、17、20号和Y染色体畸变率分别为68.4%、46.7%、73.0%、48.6%、55.3%、48.7%、54.6%、61.8%和55.5%。11、20号染色体多体与分期显著相关(P=0.011、0.005),4、9、20号染色体多体与分级显著相关(P=0.007、0.001、0.002),8、11、17、20号染色体多体与淋巴结转移显著相关(P=0.000、0.000、0.010、0.007)。联合应用3、8、10、20号探针检测食管鳞状细胞癌阳性率为57%,3、8、20号和Y探针组合在男性患者的阳性率为69%。结论食管鳞状细胞癌染色体有很高的畸变率,且与临床病理参数存在相关性,染色体着丝粒探针组合为食管癌的辅助检测提供实验依据。

FHIT基因与食管癌发生发展相关性的研究

脆性组氨酸三联体(fragilehistidinetriad,FHIT)基因是1996年克隆确定的一个人类基因,它是作为一个候选抑癌基因被提出的,它被发现在多种肿瘤组织中表达异常。属于组氨酸三联体基因家族,定位于染色体3p14.2区域,其cDNA长1095bp。经研究发现FHIT基因的主要作用为:1)FHIT可诱导细胞凋亡。2)FHIT蛋白可能通过泛素结合酶来调控细胞周期。食管癌是人类常见肿瘤,我国是食管癌高发国家,所以研究其早期诊断方法有很大的临床价值,近年来在研究食管癌的发生与FHIT基因的关系时发现:食管癌在早期阶段大都有FHIT基因的表达缺失。而FHIT基因的甲基化是其中的重要机制,其甲基化是FHIT基因失活的前提。同时,研究发现监测FHIT基因表达缺失对与食管癌的早期诊断及估计预后有一定价值。

NGAL基因3′端序列转录调控元件的克隆与鉴定

目的:将不同长度的NGAL基因 3′端序列(包括外显子、内含子和部分3′侧 翼非翻译序列)克隆到pGL3 Promote (pGLP)载体中,通过检测报告基因荧光素 酶活力,确认NGAL3′端序列中是否含有增 强子或抑制子元件。方法:应用PCR技术 从SHEEC细胞基因组DNA中扩增出不同 长度的NGAL基因片段F5(1880bp)和F (826bp),将其克隆到pGEM Teasy载体 并测序验证;再亚克隆到pGL3 Promoter载 体中,获得pGLP F5和pGLP F7表达载体 将pGLP F5和pGLP F7载体分别与pRL TK载体共转染HeLa、EC109和Vero细胞 通过检测相对荧光素酶活力,确认这些 NGAL基因片段中是否含有增强子元件 结果:我们成功构建了pGLP F5和pGLP F 重组载体。Hela、EC109和Vero转染细胞 与pGL3 Promoter相比,酶活力未表现出明 显的增强或减弱。结论:在本研究的实验 条件下,NGAL基因F5和F7片段内潜在的 顺式作用元件并没有发挥作用,或作用不 明显。

食管鳞癌细胞株KYSE150 Aurora-A高表达基因表达谱的差异分析

目的:分析高表达Aurora-A的细胞株KYSE150/GFP-Aur与对照细胞株KYSE150/GFP之间的基因表达谱差异,探讨Aurora-A高表达与相关基因表达差异之间的相关性。方法:按一步法抽提KYSE150/GFP-Aur与KYSE150/GFP细胞的总RNA,将其纯化后逆转录,以Cy5和Cy3标记cDNA作为探针,在表达谱芯片上进行杂交。经激光扫描仪扫描荧光信号图像,采用GenePix Pro4.0图像分析软件对芯片图像进行数字化处理和分析。结果:按差异显著性标准筛选出差异表达基因139个,其中呈上调表达的基因97个,呈下调表达的基因42个。Aurora-A高表达导致了多个肿瘤发生发展相关基因的表达变化,主要涉及细胞凋亡、增殖、侵袭、转移、DNA修复和细胞周期调控等5类基因。结论:对该表达谱芯片的分析能够高通量筛选一组Aurora-A高表达后发生表达改变的基因,为揭示肿瘤发生发展的分子机制提供了新的研究思路。