PD-L1/PD-L2对食管鳞癌细胞恶性表型的影响及耐药研究

目的探讨程序性死亡配体1/2(PD-L1/PD-L2)对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及对化疗药物的敏感性。方法在体外食管鳞癌KYSE150细胞系水平上,分别构建PD-L1杂合子敲除细胞系,慢病毒转染PD-L2过表达,将细胞分为WT组(PD-L1野生型)和PD-L1^(+/-)组(PD-L1杂合子敲除)、Ctrl组(对照)和OE-PD-L2组(PD-L2过表达),用RT-qPCR和Western blot验证PD-L1杂合子敲除和慢病毒转染PD-L2过表达效果以用于后续实验。采用EdU、细胞克隆形成实验、Transwell实验检测各组细胞增殖、迁移和侵袭能力。通过CCK8法检测细胞增殖能力并计算抑制率来评估细胞对化疗药物的敏感性。结果与野生型WT组相比,PD-L1^(+/-)组细胞增殖(P<0.001)、迁移(P<0.01)和侵袭能力(P<0.05)明显降低,差异有统计学意义。与Ctrl组相比,OE-PD-L2组细胞增殖和迁移能力增加(P<0.05),而侵袭能力无明显差异(P>0.05)。在顺铂药物梯度浓度干预下,与WT组相比较,PD-L1^(+/-)组细胞增殖活力明显下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。当顺铂药物浓度为20μmol/L时,与Ctrl组相比,OE-PD-L2组细胞增殖活力无明显变化(P>0.05),而在40μmol/L药物浓度作用下,与Ctrl组相比,OE-PD-L2组细胞增殖活力显著上升,差异有统计学意义(P<0.001)。加入不同浓度的五氟尿嘧啶后发现,与WT组相比,PD-L1^(+/-)组细胞增殖活力显著升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与Ctrl组相比,OE-PD-L2组细胞增殖活力显著下降(P<0.01)。比较WT组与PD-L1^(+/-)组特异性表达差异的蛋白,共获得25个差异表达蛋白质,其中差异倍数最为显著的上调蛋白为EGFR(Ser1070),下调蛋白为Smad4。结论PD-L1能够促进食管鳞癌细胞的恶性表型;PD-L2可以促进食管鳞癌细胞(ESCC)的增殖和迁移;PD-L1/PD-L2可以影响肿瘤细胞对顺铂和五氟尿嘧啶化疗药物的敏感性。

敲低膜联蛋白A2对食管鳞癌细胞恶性表型的抑制作用

目的:利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲低膜联蛋白A2(ANXA2)基因的食管鳞癌细胞,研究该基因对食管鳞癌细胞表型的影响。方法:在公共数据库中查找ANXA2基因及对照的向导RNA(gRNA),选取6个ANXA2 gRNA及1个对照gRNA,使用CRISPR/Cas9载体构建表达ANXA2 gRNA的重组质粒,转入HEK293FT细胞制备gRNA/Cas9慢病毒,将慢病毒感染食管鳞癌KYSE30和KYSE150细胞后,使用嘌呤霉素筛选阳性细胞并扩大培养。采用Western blot检测ANXA2蛋白及其下游MYC蛋白的表达情况,逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测ANXA2 mRNA表达情况,Transwell和集落形成实验分别检测细胞迁移侵袭和集落形成能力的变化。结果:成功构建了CRISPR/Cas9质粒;Sanger测序结果表明,ANXA2基因敲低质粒及对照质粒均构建成功。与对照组比较,病毒感染细胞后,Western blot结果显示,其中两个gRNA靶点病毒感染的KYSE30细胞中ANXA2蛋白及其下游MYC蛋白水平均显著降低(P<0.05);同时RT-qPCR结果证实,上述两个靶点显著下调ANXA2的mRNA表达水平(P<0.05)。Transwell和集落形成实验结果显示,敲低ANXA2后,细胞迁移侵袭能力和集落形成能力均显著减弱(P<0.05)。结论:ANXA2基因敲低显著抑制了食管鳞癌细胞的恶性表型,为进一步研究ANXA2促进食管鳞癌细胞恶性表型的作用机制提供了细胞模型和实验基础。

通幽汤对食管鳞癌细胞MMP-2、MMP-9及TIMP-1表达的影响

目的:探讨通幽汤对食管鳞癌细胞基质金属蛋白酶2、9(MMP-2、MMP-9)及基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP-1)的影响。方法:体外培养食管鳞癌KYSE150细胞,通幽汤全方作用于细胞,CCK-8实验检测细胞增殖变化,细胞划痕实验观察细胞迁移情况,Transwell法观察细胞侵袭情况,荧光显微镜观察细胞凋亡情况,ELISA法测定食管鳞癌细胞培养上清液中MMP-2、MMP-9、TIMP-1含量,Western-blot法检测细胞MMP-2、MMP-9、N-钙黏联蛋白(N-cadherin)、TIMP-1、E-钙黏联蛋白(E-cadherin)表达量变化。结果:与对照组比较,研究组食管鳞癌细胞迁移速率和侵袭能力下降,MMP-2、MMP-9、N-cadherin蛋白水平降低,TIMP-1、Ecadherin蛋白水平升高。结论:通幽汤可能通过调控食管鳞癌细胞侵袭和转移中的关键分子MMP-2、MMP-9、TIMP-1及钙黏联蛋白的表达,抑制癌细胞的侵袭和转移。

吴茱萸碱增强Eca-109食管鳞癌细胞的放射敏感性

目的探讨吴茱萸碱(Evo)对Eca-109食管鳞癌细胞放射敏感性的影响,探索其可能机制。方法采用MTT法检测(10、20、40、60、80、100、120)μg/m L吴茱萸碱对Eca-109细胞生长的抑制作用,确定最佳处理剂量。实验分为放射组(仅给予0、2、4、6、8 Gy X线照射处理)、联合组(给予80μg/m L吴茱萸碱和0、2、4、6、8 Gy X线照射处理),克隆形成实验检测吴茱萸碱对Eca-109细胞克隆形成能力的影响,流式细胞术检测细胞周期;Western blot法检测Eca-109细胞中Ku70、Ku80、DNA激活蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)、DNA双链修复蛋白Rad51蛋白水平。结果吴茱萸碱呈剂量依赖性抑制Eca-109细胞的生长,80μg/m L吴茱萸碱的抑制作用最大。克隆形成实验结果显示80μg/m L吴茱萸碱联合放射治疗后,平均致死剂量(D0)、准域剂量(Dq)值显著小于单纯放射时的值,放射增敏比(SER)为1.86±0.06,拟合的生存曲线左移。吴茱萸碱可减少放射诱导的细胞G2/M期阻滞,可显著抑制放射诱导的Ku70、Ku80、DNA-PKcs、Rad51蛋白上调。结论吴茱萸碱具有增加食管鳞癌细胞株Eca-109放射敏感性的作用,可能与抑制细胞周期G2/M期阻滞和降低DNA损伤修复蛋白表达水平有关。

神经生长因子受体阳性的人食管鳞癌细胞的分选及其干细胞特性

目的应用免疫磁珠分选(magnetic activated cell sorting,MACS)法分选人食管鳞癌细胞(esophagealsquamous carcinoma cell,ESCC)中的神经生长因子受体(nerve growth factor receptor,NGFR)阳性细胞,并对其肿瘤干细胞样特征进行研究。方法采用MACS分选人ESCC中的NGFR阳性细胞。通过流式细胞仪法测定分选细胞的纯度及细胞周期分布,并计算细胞回收率;MTT法测定细胞数,绘制生长曲线并计算细胞群体倍增时间;平板克隆实验测定平板克隆形成率;裸鼠接种成瘤实验测定体内致瘤性,从而鉴定NGFR阳性ESCC的干细胞特性。结果 NGFR阳性细胞约占肿瘤细胞的1.89%,经过磁珠分选后纯度显著提高,达89.94%,细胞回收率为19.83%。与未分选细胞相比,分选后NGFR阳性细胞的增殖速度明显提高,生长曲线左移,细胞倍增时间缩短[(25.22±8.15)hvs.(47.41±12.69)h,P=0.01],平板克隆形成率显著增加[(16.27±8.31)%vs.(1.22±0.35)%,P=0.00],处于活跃增殖期S、G2、M期的细胞显著增加(72.7%vs.18.8%);裸鼠皮下接种的转移瘤形成率增加(8/10vs.1/10),转移瘤重量显著增加[(0.72±0.53)gvs.(0.16±0.26)g,P=0.00]。结论应用MACS技术能有效分选出人ESCC中的NGFR阳性细胞,其具有肿瘤干细胞特性。

p15^(INK4B)基因转染对人食管鳞癌细胞EC109增殖的抑制作用

目的:探讨p15INK4B(p15)基因转染对食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖的影响.方法:根据转染质粒的不同和是否进行质粒转染分为3组:p15转染组,空载体转染组,未转染组.应用PCR检测外源性p15基因,Westernblot方法检测转染细胞的P15蛋白变化:流式细胞仪分析细胞周期变化,应用MTT、集落形成实验、流式细胞仪和透射电镜检测转染外源p15基因对EC109细胞增殖和凋亡的影响.结果:p15转染细胞存在外源p15基因,并有P15蛋白高表达;EC109-p15细胞生长速度低于对照细胞EC109-空载体组和未转染组,集落形成率显著低于对照细胞EC109-空载体组和未转染组(20.8±1.3%vs54.3±3.2%,56.8±2.3%,P<0.01);流式细胞仪观察到P15蛋白高表达使EC109细胞发生G1/S阻滞,G1期细胞比例显著高于空载体组和未转染组(62.4±7.1%vs38.0±5.8%,34.4±1.0%,P<0.01),S期比例显著低于空载体组和未转染组(21.1±1.3%vs35.5±2.4%,36.3±0.7%,P<0.01),并出现亚G1峰(凋亡峰).透射电镜亦发现p15转染组发生细胞凋亡.结论:p15基因转染可以抑制人食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖并能诱导其发生细胞凋亡.

沉默PHF8重组慢病毒的制备及其对食管鳞癌细胞增生的影响

目的制备锌指蛋白8(plant homeodomain finger protein 8,PHF8)RNA干扰(RNA interference,RNAi)重组慢病毒(lentivirus)颗粒,建立PHF8表达沉默的人食管鳞癌(esophageal squamous-cell carcinoma,ESCC)稳定细胞系并观察PHF8对细胞增生的影响。方法将目的基因或阴性对照短发卡RNA(short hairpin RNA,shRNA)载体与包装载体共转染病毒包装细胞293T,收集并浓缩上清液获得重组慢病毒;测定病毒滴度后用于感染食管鳞癌细胞;通过荧光显微镜及流式细胞仪观察感染效率,嘌呤霉素筛选法建立稳定细胞系;定量PCR及Western Blotting检测PHF8的表达沉默;MTS法检测细胞的增生特性。结果成功制备了沉默PHF8的重组慢病毒;应用重组病毒感染食管鳞癌细胞后,PHF8 mRNA和蛋白的表达水平显著降低,细胞的增生明显下降。结论慢病毒介导的shRNA干扰能有效抑制食管鳞癌细胞的PHF8表达及细胞增生。

miR-205-5p对RBM47的调控作用及对食管鳞癌细胞侵袭迁移的影响

目的探讨微小RNA-205-5p(miR-205-5p)对RNA结合蛋白47(RBM47)的调控作用,及对食管鳞癌细胞侵袭迁移的影响。方法取人食管鳞状细胞癌细胞系(TE14和KYSE70)和人食管上皮细胞(HET-1A),实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)检测各组细胞miR-205-5p、RBM47 mRNA表达水平。取KYSE70细胞,分为空白对照组、miR-205-5p抑制剂(miR-205-5p-inhibitor)组、miR-205-5p抑制剂阴性对照(miR-205-5p-NC)组、RBM47过表达腺病毒(Ad-RBM47)组、Ad-RBM47阴性对照(Ad-eGFP)组。RT-qPCR检测各组细胞miR-205-5p、RBM47 mRNA表达水平;用CCK-8法检测各组细胞增殖活性;Transwell小室法检测细胞迁移侵袭能力;蛋白免疫印迹法(Western blot)法检测各组细胞RBM47、侵袭迁移相关蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)及锌指E-盒结合同源异形盒1(ZEB1)。双荧光素酶活性实验验证miR-205-5p与RBM47的靶向关系。将miR-205-5p-inhibitor与RBM47干扰载体(si-RBM47)及空载体(si-RNA-NC)共转染,分为miR-205-5p-inhibitor+si-RBM47组、miR-205-5p-inhibitor+si-RNA-NC组、miR-205-5p-NC+si-RBM47组、miR-205-5p-NC+si-RNA-NC组、未转染组(空白对照组),并检测各组细胞转染后侵袭迁移能力。结果与HET-1A细胞系相比,ESCC细胞系(TE14和KYSE70)中miR-205-5p表达升高(P<0.05),RBM47 mRNA表达降低(P<0.05),在KYSE70细胞系中,miR-205-5p表达最高,RBM47 mRNA表达最低,选用KYSE70细胞系进行后续试验。抑制miR-205-5p或激活RBM47表达后,与空白对照组比较,miR-205-5p-inhibitor组及Ad-RBM47组细胞增殖活性、侵袭迁移能力、ZEB1蛋白表达降低(P<0.05),RBM47、E-cadherin表达升高(P<0.05);miR-205-5p-NC组及Ad-eGFP组上述指标与空白组对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。miR-205-5p-inhibitor与si-RBM47共转染后,与空白组对照组比较,miR-125b-NC+si-RBM47组细胞侵袭迁移能力升高(P<0.05);miR-205-5p-inhibitor+si-RNA-NC组细胞侵袭迁移能力降低(P<0.05)。与miR-205-5p-inhibitor+si-RNA-NC组相比,miR-205-5p-inhibitor+si-RBM47组细胞侵袭迁移能力升高(P<0.05);miR-125b-NC+si-RNA-NC组与空白对照组相比,上述指标差异无统计学意义(P>0.05)。双荧光素酶活性试验显示,与miR-205-5p-NC+RBM47-3′UTR-WT组比较,miR-205-5p-mimics+RBM47-3′UTR-WT组荧光素酶活性降低(P<0.05),miR-205-5p-NC+RBM47-3′UTR-MUT组、miR-205-5p-mimics+RBM47-3′UTR-MUT组荧光素酶活性比较差异无统计学意义(P>0.05),miR-205-5p与RBM47有结合位点,且呈靶向负调控作用。结论Escc细胞中miR-205-5p表达升高,RBM47表达降低,下调miR-205-5p表达可抑制Escc细胞侵袭迁移能力,可能与上调RBM47表达有关。

TLR9的激活对食管鳞癌细胞的增殖侵袭能力及NF-κB表达的影响

目的探索Toll样受体9(Toll-like receptor 9,TLR9)的激活对食管鳞癌细胞的增殖侵袭能力及NF-κB表达的影响。方法流式细胞术检测TLR9在食管鳞癌细胞TE-3、TE-13、TE-15、TE-30中的表达;免疫荧光法检测TLR9在TE-13细胞中的表达;用CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)激活TE-13,实验分为阴性对照组(control)、低剂量CpG-ODN组(1μg/mL)、中剂量CpG-ODN组(3μg/mL)和高剂量CpG-ODN组(12μg/mL)。RT-qPCR检测食管鳞癌细胞TE13中TLR9和NF-κB mRNA相对表达量的变化;采用CCK-8和Transwell法分别检测TLR9的激活对TE-13细胞增殖和侵袭能力的影响。结果①TLR9在TE-13表达量高于其他3种食管鳞癌细胞系。②3、12μg/mL CpGODN作用后TE-13细胞中TLR9被充分激活并且上调NF-κB的表达,TLR9和NF-κB的表达显著均高于阴性对照组(P<0.05);低剂量CpG-ODN组与阴性组相比差异无统计学意义(P>0.05)。③CCK-8和Transwell法检测发现CpGODN浓度在3、12μg/mL时TLR9的激活可显著增加TE-13细胞的增殖和侵袭能力(P<0.05),激活作用具有浓度依赖性。低剂量CpG-ODN组与阴性组相比差异无统计学意义(P>0.05)。结论CpG-ODN可通过TLR9/NF-κB促进食管鳞癌细胞的增殖和侵袭,提示TLR9可能是治疗食管鳞癌的重要靶点。

神经生长因子受体阳性人食管鳞癌细胞对紫杉醇的耐药性研究

目的 探讨神经生长因子受体阳性（NGFR＋）人食管鳞癌细胞株EC9706对紫杉醇的耐药性.方法 采用噻唑蓝法药物敏感试验测定NGFR＋ EC9706细胞的耐药指数,采用小鼠致瘤实验模型评估紫杉醇作用下的NGFR＋ EC9706细胞与未分选EC9706细胞异种移植肿瘤生长的差异.结果 NGFR＋EC9706细胞的耐药指数为2.03,NGFR＋ EC9706细胞致瘤的紫杉醇组与0.9％氯化钠溶液组瘤重无明显差异（P＞0.05）,实体瘤大小差别不明显.而未分选EC9706细胞致瘤的紫杉醇组与0.9％氯化钠溶液组比较瘤重明显减小[（0.5±0.4）g比（1.9±1.0）g],差异有统计学意义（P＜0.05）,实体瘤也明显减小.未分选EC9706细胞致瘤的紫杉醇组较NGFR＋ EC9706细胞致瘤的紫杉醇组瘤重明显减小[（0.5±0.4）g比（1.3±0.4）g],差异有统计学意义（P＜0.05）.结论 人食管鳞癌细胞中的NGFR＋ EC9706细胞对紫杉醇具有一定的耐药性.

抗原负载的树突状细胞对食管鳞癌细胞体外杀伤作用的实验研究

近年来，生物治疗由于它抗肿瘤的独特特点，在恶性肿瘤的治疗中发挥着重要作用。树突状细胞（DendriticCells，DC）作为肿瘤生物治疗中的一种，近年来研究的比较多，尤其在递呈抗原抗肿瘤方面。本实验通过抗原负载的DC对食道癌细胞体外杀伤作用进行研究。

罗哌卡因对食管鳞癌细胞FAK/ERK通路及细胞学行为的影响

目的:观察罗哌卡因对人食管鳞状癌细胞(KYSE150)增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响,并探讨其作用机制。方法:体外培养KYSE150细胞,随机分为对照组、罗哌卡因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组(10,20,50μg·ml-1)。采用噻唑蓝(MTT)法检测罗哌卡因对KYSE150细胞的增殖抑制作用;划痕实验检测各组KYSE150细胞迁移能力变化情况;Transwell法检测各组KYSE150细胞的侵袭能力;Annexin V-FITC/PI双染法检测各组KYSE150细胞凋亡情况;蛋白免疫印迹分析法检测黏着斑激酶(FAK)、磷酸化FAK(p-FAK)、信号调节激酶(ERK)、磷酸化ERK (p-ERK)蛋白表达情况。结果:与对照组相比,罗哌卡因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组KYSE150细胞存活率依次降低(P<0.05),并呈剂量依赖性(P<0.05);与对照组相比,罗哌卡因Ⅰ组KYSE150细胞愈合率、侵袭数量、凋亡率、p-FAK和p-ERK蛋白表达量差异均无统计学差异(P>0.05);与对照组及罗哌卡因Ⅰ组相比,罗哌卡因Ⅱ、Ⅲ组KYSE150细胞愈合率、侵袭数量、p-FAK和p-ERK蛋白表达量依次降低(P<0.05),KYSE150细胞凋亡率依次升高(P<0.05);各组KYSE150细胞中FAK和ERK蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论:罗哌卡因可能通过下调p-FAK/pERK蛋白表达水平从而影响人食管鳞状癌细胞迁移、侵袭和凋亡行为。

冬凌草甲素对人食管鳞癌细胞系KYSE-150和KYSE-450增殖及迁移的影响

目的探讨冬凌草甲素(ORI)对食管鳞癌细胞系KYSE-150和KYSE-450增殖、凋亡、周期及迁移的作用。方法 MTT法检测ORI对食管癌细胞增殖的影响;集落形成实验检测ORI对集落形成的影响;流式细胞术检测ORI对食管癌细胞凋亡和周期的影响;Transwell迁移实验检测ORI对食管癌细胞迁移的作用;Western blotting检测ORI对抗凋亡蛋白Bcl-2、细胞周期抑制蛋白p21Cip1/Waf1及上皮-间质转化(EMT)标志蛋白表达水平的影响。结果 ORI对KYSE-150和KYSE-450细胞的增殖、迁移和集落形成有显著的抑制作用(P<0.05),且抑制作用呈一定的时间、剂量依赖性;流式结果显示,随着ORI浓度的增加,细胞的凋亡率明显增加(P<0.05),G2/M期细胞比例显著增加(P<0.05),G0/G1期细胞比例明显下降(P<0.05);ORI处理食管癌细胞48 h,Bcl-2、间质细胞标志蛋白,波形蛋白(vimentin)、β-连环蛋白(β-catenin)表达下调,p21Cip1/Waf1、上皮细胞标志蛋白,E-钙黏蛋白(E-cadherin)表达上调。结论冬凌草甲素可能通过诱导细胞凋亡,阻滞细胞在G2/M期抑制食管癌细胞的增殖,并通过抑制EMT转化从而抑制食管癌细胞的迁移。

Toll样受体9在食管鳞癌细胞的表达及作用

目的观察Toll样受体9(TLR9)在食管鳞癌细胞的表达及作用。方法用RT-PCR方法检测食管鳞癌细胞系TE10、TE30和TE70上TLR9的表达;流式细胞术检测TE10细胞上TLR9的表达;用TLR9的激动剂CpG寡脱氧核苷酸(CpG ODN)10μg/ml分别作用TE10细胞12 h、24 h和48 h后,用MTT法检测细胞生长抑制率。结果 TE10细胞上有TLR9的表达;TLR 9激动剂CpG ODN作用于TE10细胞后不同时间均能明显促进TE10细胞生长(P<0.01)。结论 TLR9激动剂CpG ODN可促进食管鳞癌细胞的增殖,提示TLR9可能是食管鳞癌治疗的靶点之一。

食管鳞癌细胞系EC109射线照射后miRNAs和DNA-PKcs的变化及相关性分析

目的探讨食管鳞癌细胞X-Ray照射后miR-126、miR-21、miR-101的表达情况及其与DNA损伤修复基因DNA-PKcs的关系。方法实时定量PCR检测不同剂量X-Ray照射EC109食管鳞癌细胞株24 h后,miR-126、miR-21、miR-101、DNA-PKcs mRNA和蛋白的表达。结果 X-Ray照射EC109后,miR-126、miR-101和DNA-PKcs mRNA表达升高(P<0.05)。放射照射后DNA-PKcs蛋白水平有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。其中miR-21与DNA-PKcs mRNA表达呈负相关。3个miRNAs表达和DNAPKcs蛋白表达无明显相关性。结论 X-Ray照射后,食管鳞癌细胞系EC109的miR-126和miR-101表达上调,DNA-PKcs mRNA表达上调,miR-21与DNA-PKcs mRNA表达呈负相关。

雷公藤内酯醇联合顺铂对食管鳞癌细胞ECA-109增殖的影响

目的观察雷公藤内酯醇(TPL)以及TPL联合顺铂对人食管鳞癌细胞ECA-109增殖的影响,并探讨其作用机制。方法选取对数生长期的人ECA-109细胞,随机分为空白对照组(不经药物处理)、不同浓度(6.25、12.50、25.00、50.00、100.00μg·L^(-1))TPL组、4.17μmol·L^(-1)顺铂组、TPL(25.00μg·L^(-1))联合顺铂(4.17μmol·L^(-1))组;采用四甲基偶氮唑蓝法测定各组不同时间段(24、48、72 h)的细胞增殖抑制率,并计算TPL与顺铂之间的交互作用;采用Western blot检测空白对照组、25.00μg·L^(-1)TPL处理组、4.17μmol·L^(-1)顺铂组、TPL联合顺铂组细胞培养24 h后半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(caspase-3)的表达。结果同一时间点,不同浓度TPL组对ECA-109细胞增殖的抑制率显著高于空白对照组(P<0.05),且呈剂量依赖性(P<0.05);同一药物浓度条件下,随作用时间延长,细胞增殖抑制率显著增加(P<0.05),即呈时间依赖性。同一时间点,TPL联合顺铂组对ECA-109的抑制率高于同药物浓度条件下单用顺铂或单用TPL对细胞增殖的抑制率(P<0.05)。加药培养24 h后,TPL组、顺铂组及TPL联合顺铂组caspase-3蛋白表达量均显著高于空白对照组(P<0.05),且TPL联合顺铂组caspase-3蛋白表达量高于同药物浓度条件下单用TPL组、单用顺铂组蛋白表达量(P<0.05)。结论 TPL具有抑制食管癌ECA-109细胞增殖的作用,TPL联合顺铂有协同作用,增加对食管癌ECA-109细胞的抑制,其机制可能与促进caspase-3蛋白表达有关。

U0126对食管鳞癌细胞迁移的影响

目的探讨丝裂原细胞外信号调节激酶(MEK)1/2抑制剂U0126对食管鳞癌细胞迁移的影响及可能的分子机制。方法培养人食管鳞癌细胞系KYSE-150,Transwell迁移实验和划痕实验评价细胞垂直和横向迁移情况,Western印迹法检测上皮间质转化(EMT)相关标记物的蛋白表达。结果Transwell实验结果表明,与对照组相比,不同浓度U0126处理KYSE-150细胞后,细胞垂直向迁移能力明显增强(P<0.05)。细胞划痕实验结果表明,与对照组相比,不同浓度U0126处理KYSE-150细胞后,细胞水平迁移能力明显增强,除0.5μmol/L U012624 h时外,其余差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比,U0126处理KYSE-150细胞后,p-ERK1/2、E-cadherin表达明显降低,β-catenin表达明显升高(P<0.05)。结论U0126以剂量依赖的方式促进KYSE-150细胞迁移,其机制可能与下调E-cadherin,上调β-catenin表达有关。

微小RNA-21转染介导食管鳞癌细胞生物学行为及细胞放射敏感性的变化

目的探讨微小RNA-21(miRNA-21)表达介导食管鳞癌细胞的生物学特性。方法转染miRNA-21正义表达载体、miRNA-21空载体及miRNA-21抑制剂,通过Real-time PCR实验,以食管鳞状上皮癌TE-1正常细胞为对照组,检测转染结果。采用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)对细胞增殖活性进行检测;采用流式细胞术检测细胞凋亡能力;通过Transwell小室和划痕实验观察TE-1细胞侵袭能力及迁移能力;通过集落形成实验观察TE-1细胞对放疗敏感性变化;采用SPSS 19.0统计学软件对所得数据进行分析。结果Real-time PCR结果显示,转染miRNA-21抑制剂后,TE-1细胞中miRNA-21的表达水平明显降低(P<0.05)。相比正常细胞生长组,阳性对照组、阴性对照组转染miRNA-21抑制剂后,TE-1细胞增殖能力降低,细胞凋亡加快(P<0.05)。此外,实验抑制组中细胞侵袭和迁移能力下降。集落形成实验分析显示,抑制miRNA-21表达明显提高了TE-1细胞对放射的敏感性。结论下调miRNA-21可降低食管鳞状上皮癌TE-1细胞的增殖、侵袭、迁移能力及放疗的敏感性,是未来治疗食管癌的潜在靶点。

曲古抑菌素A通过调控蛋白激酶C促进食管鳞癌细胞迁移

目的探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TSA)对人食管鳞癌细胞(ESCC)迁移能力的影响及其可能的作用机制。方法培养食管鳞癌细胞KYSE-150和EC9706;Transwell法检测TSA、蛋白激酶C(PKC)抑制剂AEB071对食管鳞癌细胞迁移的影响;观察TSA、PKC抑制剂AEB071对人食管鳞癌细胞形态学的影响;Western blotting检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、β-连环蛋白(β-catenin)、Slug、ac H3和H3蛋白的表达水平。结果TSA促进食管鳞癌细胞的迁移,PKC抑制剂AEB071部分抑制TSA促进食管鳞癌细胞的迁移作用;TSA促使细胞由类椭圆形的上皮样细胞形态向类似梭形的成纤维细胞样形态的上皮-间质转化(EMT),AEB071抑制TSA诱导的细胞形态学变化;TSA处理后E-cadherin蛋白表达水平降低,vimentin、β-catenin、Slug、ac H3表达水平升高,联合应用TSA与AEB071,TSA诱导的上述EMT相关蛋白水平的变化得到部分抑制,使E-cadherin蛋白表达水平增加,vimentin、β-catenin、Slug表达水平降低。结论TSA通过促进食管鳞癌细胞EMT增加其迁移能力,其机制可能由PKC相关信号通路介导。

食管鳞癌细胞培养上清液对正常CD3^+CD56^+NKT细胞亚型、表面受体及效应分子表达的影响

目的观察食管鳞癌细胞株培养上清液对健康人外周血CD3^+CD56^+NKT细胞亚型、表面受体及效应分子表达的影响。方法取30例健康志愿者的外周血,用淋巴细胞分离液常规方法分离外周血单核细胞。收集食管鳞癌细胞株Eca9706、Kyse150的培养上清液,将上清液与含10%胎牛血清的RPMI1640培养基按1∶1混合以配制条件培养基。将外周血单核细胞分为对照组、Eca9706组、Kyse150组。对照组细胞仅用含IL-2、10%胎牛血清的RPMI1640培养液培养;Eca9706组、Kyse150组细胞加入IL-2刺激24 h后,分别更换条件培养基(Eca9706细胞培养上清液、Kyse150细胞培养上清液)培养48 h。收集各组细胞,选择流式细胞仪的CD3^+CD56^+的细胞群设计分析,分析各组CD3^+CD56^+NKT细胞亚型,检测CD3^+CD56^+NKT细胞中的表面受体(NKG2D、NKG2A、NKP30、NKP44、CD158b、CD271)及效应分子(穿孔素、颗粒酶、Ki-67)。结果 Eca9706组及Kyse150组的CD3^+CD56^+NKT细胞中CD4^+CD8-NKT细胞比例高于对照组,CD4-CD8-NKT细胞比例低于对照组(P均<0.05)。Eca9706组、Kyse150组的CD3^+CD56^+NKT细胞中NKG2A、CD158b表达率高于对照组,NKP44、NKP30、CD271表达率低于对照组(P均<0.05)。Eca9706组的CD3^+CD56^+NKT细胞中穿孔素表达率低于对照组(P<0.05);Eca9706组的CD3^+CD56^+NKT细胞中Ki-67表达率高于对照组(P<0.05)。结论食管鳞癌细胞株培养上清液能改变正常CD3^+CD56^+NKT细胞的亚型,使细胞表面活化型受体和抑制型受体表达比例失衡,并下调效应分子穿孔素的表达,使CD3^+CD56^+NKT细胞的免疫监视功能受损。上述变化可能是食管鳞癌细胞逃避机体免疫监视的机制之一。