食管鳞癌细胞系EC109射线照射后miRNAs和DNA-PKcs的变化及相关性分析

目的探讨食管鳞癌细胞X-Ray照射后miR-126、miR-21、miR-101的表达情况及其与DNA损伤修复基因DNA-PKcs的关系。方法实时定量PCR检测不同剂量X-Ray照射EC109食管鳞癌细胞株24 h后,miR-126、miR-21、miR-101、DNA-PKcs mRNA和蛋白的表达。结果 X-Ray照射EC109后,miR-126、miR-101和DNA-PKcs mRNA表达升高(P<0.05)。放射照射后DNA-PKcs蛋白水平有升高趋势,但差异无统计学意义(P>0.05)。其中miR-21与DNA-PKcs mRNA表达呈负相关。3个miRNAs表达和DNAPKcs蛋白表达无明显相关性。结论 X-Ray照射后,食管鳞癌细胞系EC109的miR-126和miR-101表达上调,DNA-PKcs mRNA表达上调,miR-21与DNA-PKcs mRNA表达呈负相关。

人食管鳞癌细胞系EC109中肿瘤干细胞的分离(富集)与鉴定

目的运用无血清成球培养法从人食管鳞癌细胞系EC109中分离/富集肿瘤干细胞,并对其"干性"特性进行鉴定。方法将EC109细胞接种至添加1XB27的干细胞培养基(DMEM/F12 1:1,无血清),于poly-Hema包被的培养皿或低黏附培养板中培养,获取细胞球。采用实时定量PCR方法检测其干性相关转录因子的基因表达,连续传代和平板克隆形成实验评价其自我更新能力,免疫荧光细胞化学法检测其分化前后干性相关转录因子和分化标志物的表达变化,以裸鼠移植瘤实验检测其体内成瘤能力。结果培养5d能获得EC109细胞的细胞球。细胞球细胞高表达Oct4等干性相关转录因子,具有自我更新能力、分化潜能。裸鼠体内1×104个细胞球细胞能启动肿瘤形成,而单层培养细胞则需要1×105个细胞,且同数量级的细胞球细胞较单层培养细胞所形成的肿瘤体积大。结论无血清成球培养法能从食管鳞癌细胞系EC109获得细胞球,细胞球富集了肿瘤干细胞。

吴茱萸碱增强Eca-109食管鳞癌细胞的放射敏感性

目的探讨吴茱萸碱(Evo)对Eca-109食管鳞癌细胞放射敏感性的影响,探索其可能机制。方法采用MTT法检测(10、20、40、60、80、100、120)μg/m L吴茱萸碱对Eca-109细胞生长的抑制作用,确定最佳处理剂量。实验分为放射组(仅给予0、2、4、6、8 Gy X线照射处理)、联合组(给予80μg/m L吴茱萸碱和0、2、4、6、8 Gy X线照射处理),克隆形成实验检测吴茱萸碱对Eca-109细胞克隆形成能力的影响,流式细胞术检测细胞周期;Western blot法检测Eca-109细胞中Ku70、Ku80、DNA激活蛋白激酶催化亚基(DNA-PKcs)、DNA双链修复蛋白Rad51蛋白水平。结果吴茱萸碱呈剂量依赖性抑制Eca-109细胞的生长,80μg/m L吴茱萸碱的抑制作用最大。克隆形成实验结果显示80μg/m L吴茱萸碱联合放射治疗后,平均致死剂量(D0)、准域剂量(Dq)值显著小于单纯放射时的值,放射增敏比(SER)为1.86±0.06,拟合的生存曲线左移。吴茱萸碱可减少放射诱导的细胞G2/M期阻滞,可显著抑制放射诱导的Ku70、Ku80、DNA-PKcs、Rad51蛋白上调。结论吴茱萸碱具有增加食管鳞癌细胞株Eca-109放射敏感性的作用,可能与抑制细胞周期G2/M期阻滞和降低DNA损伤修复蛋白表达水平有关。

p15^(INK4B)基因转染对人食管鳞癌细胞EC109增殖的抑制作用

目的:探讨p15INK4B(p15)基因转染对食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖的影响.方法:根据转染质粒的不同和是否进行质粒转染分为3组:p15转染组,空载体转染组,未转染组.应用PCR检测外源性p15基因,Westernblot方法检测转染细胞的P15蛋白变化:流式细胞仪分析细胞周期变化,应用MTT、集落形成实验、流式细胞仪和透射电镜检测转染外源p15基因对EC109细胞增殖和凋亡的影响.结果:p15转染细胞存在外源p15基因,并有P15蛋白高表达;EC109-p15细胞生长速度低于对照细胞EC109-空载体组和未转染组,集落形成率显著低于对照细胞EC109-空载体组和未转染组(20.8±1.3%vs54.3±3.2%,56.8±2.3%,P<0.01);流式细胞仪观察到P15蛋白高表达使EC109细胞发生G1/S阻滞,G1期细胞比例显著高于空载体组和未转染组(62.4±7.1%vs38.0±5.8%,34.4±1.0%,P<0.01),S期比例显著低于空载体组和未转染组(21.1±1.3%vs35.5±2.4%,36.3±0.7%,P<0.01),并出现亚G1峰(凋亡峰).透射电镜亦发现p15转染组发生细胞凋亡.结论:p15基因转染可以抑制人食管鳞癌细胞系EC109细胞增殖并能诱导其发生细胞凋亡.

二氢丹参酮Ⅰ促进人食管鳞癌细胞系EC9706凋亡

目的探讨二氢丹参酮Ⅰ能否通过Wnt/β-catenin信号通路靶向调控食管鳞癌细胞系EC9706细胞增殖、迁移、凋亡等肿瘤细胞生物学特性。方法将EC9706细胞培养于含0、10和30μmol/L的二氢丹参酮Ⅰ溶液中,用CCK-8法检测细胞增殖;划痕试验检测细胞迁移;Western blot检测细胞内β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白表达;流式细胞计量术检测细胞凋亡。结果二氢丹参酮Ⅰ能够有效抑制EC9706细胞的增殖和迁移;二氢丹参酮Ⅰ可下调细胞中β-catenin、cyclin D1和c-myc蛋白的表达(P<0.05);二氢丹参酮Ⅰ可呈剂量依赖性地促进细胞凋亡。结论二氢丹参酮Ⅰ能够抑制EC9706细胞的增殖和迁移,并能促进EC9706细胞凋亡。

肿瘤转移抑制基因-1在食管鳞癌组织及食管癌EC109细胞中的表达及意义

目的探讨肿瘤转移抑制基因-1(TMSG-1)在食管鳞癌(ESCC)组织及食管癌EC109细胞中的表达及意义。方法采用SP免疫组织化学染色法检测136例ESCC及37例正常食管黏膜组织中TMSG-1蛋白的表达情况,分析TMSG-1与ESCC患者临床病理指标的关系;培养人食管癌EC109细胞并用常用化疗药物顺铂(CDDP)干预,同时设对照组,采用MTT法检测细胞增殖抑制率,半定量RT-PCR法检测细胞TMSG-1的表达情况。结果 TMSG-1在ESCC和正常食管黏膜的阳性率分别为52.2%(71/136)、94.6%(35/37),差异具有统计学意义(P<0.05)。TMSG-1的异常表达与ESCC组织学分级、患者的TNM分期、淋巴结转移情况相关。顺铂干预组EC109细胞的增殖抑制率较对照组显著增高,差异具有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR结果显示,干预组EC109细胞TMSG-1的mRNA表达明显高于对照组(P<0.01)。结论 TMSG-1的异常表达与ESCC的发展及转移相关,可作为较为理想的肿瘤标志物辅助诊断并指导临床治疗。

DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人食管癌细胞株Eca109的影响

目的:探讨DNA甲基转移酶抑制剂5-杂氮-2′-脱氧胞苷(5-aza-CdR)对人食管癌细胞株Eca109增殖作用的影响。方法:应用不同浓度(10-7、10-6、10-5、10-4mol/L)的特异性DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-CdR,于不同作用时间(24～168h)处理人食管鳞癌细胞株Eca109,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定5-aza-CdR作用下Eca109细胞株的生存率,倒置显微镜观察细胞的形态学变化。结果:不同药物浓度组在同一作用时间下,细胞株生存率差异有统计学意义(P<0.05);同一药物浓度不同作用时间组之间(24～96h)的细胞生存率差异也有统计学意义(P<0.05),且96h时对人食管鳞癌细胞株Eca109生长抑制作用最明显。形态学观察显示:癌细胞体积缩小,核固缩,染色质凝聚成块。结论:5-aza-CdR有抑制人食管癌细胞株Eca109生长的作用,抑制作用呈时间依赖性及浓度依赖性;并且干预后癌细胞呈现典型的凋亡细胞形态改变。

食管鳞状细胞癌组织中BTG-1的表达及其对食管鳞状细胞癌细胞株EC9706凋亡的影响

目的分析食管鳞状细胞癌组织中B细胞转位基因1(BTG-1)的表达及其对食管鳞状细胞癌细胞株EC9706凋亡的影响。方法选取郑州大学第一附属医院2014年1月～2017年12月存档的164个鳞状细胞癌存档手术或内镜活检蜡块、76个癌旁正常组织手术蜡块作为研究对象,采用免疫组化法、原位杂交检测BTG1蛋白表达并分析其与病理参数的关系;建立BTG-1过量表达细胞株,Anncxin V-FITC/PI双标记流式细胞仪检测人食管鳞状细胞癌细胞株EC9706的凋亡情况。结果食管鳞状细胞癌组织BTG-1蛋白、信使核糖核酸(m RNA)阳性表达率低于癌旁正常组织(χ～2=32.718、55.729,均P<0.001);且有淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、组织学分级Ⅱ～Ⅲ级标本中BTG-1蛋白、m RNA阳性表达率显著较低(χ～2=29.078、5.970、7.660、31.127、8.624、10.624,均P<0.001);且BTG-1组早期细胞凋亡率显著高于空白对照组(t=15.484,P<0.001)。结论食管鳞状细胞癌组织中BTG1的表达显著低于癌旁正常组织,且其与有无淋巴结转移、TNM分期、组织学分级的关系密切,BTG-1高表达或可促进食管鳞状细胞癌细胞凋亡。

桥接整合因子1去甲基化诱导细胞周期阻滞抑制食管鳞状细胞癌EC109细胞增殖

目的:分析桥接整合因子1(bridging integrator-1,Bin1)去甲基化对Bin1基因表达和食管鳞状细胞癌EC109细胞增殖能力的影响,并初步探讨其可能的作用机制。方法:甲基化特异性PCR(methylation specific polymerase chain reaction,MSP)法检测去甲基化药物5-氮杂-2'脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dc)处理后EC109细胞Bin1启动子区域的甲基化状态,用qPCR、Western blotting和MTT法分别检测单独5-Aza-dc和5-Aza-dc加转染Bin1基因干扰片段(Bin1 siRNA)处理对EC109细胞Bin1 mRNA及其蛋白表达和细胞增殖能力的影响,流式细胞术和Western blotting检测5-Aza-dc处理后EC109细胞周期和细胞周期相关蛋白(Cyclin D1与CDK4)表达的变化。结果:去甲基化药物5-Aza-dc处理后,EC109细胞Bin1基因启动子区域发生去甲基化。5-Aza-dc处理的Bin1去甲基化EC109细胞Bin1 m RNA和蛋白表达明显上调(均P<0.05),细胞增殖能力明显下降(P<0.05),细胞阻滞在G0/G1期,表现为S期细胞比例显著减少,细胞周期相关蛋白Cyclin D、CDK4表达均明显下调(均P<0.05)。Bin1去甲基化EC109细胞转染Bin1 siRNA后,Bin1 mRNA和蛋白表达明显下调,细胞增殖能力增强(均P<0.05)。结论:Bin1基因启动子区域在EC109细胞中呈完全甲基化状态,5-Aza-dc去甲基化可使食管鳞癌细胞EC109细胞Bin1表达升高,通过降低细胞周期相关蛋白表达诱导细胞周期阻滞抑制EC109细胞增殖。证实表观遗传学变化可能与食管癌细胞恶性增殖有关,可为食管癌治疗提供新的思路。

辣椒素对食管鳞状细胞癌细胞凋亡和NF-κB信号通路相关蛋白表达的影响

目的:探讨辣椒素对食管鳞状细胞癌(食管鳞癌)细胞凋亡和NF-κB信号通路的影响。方法:采用Westernblot法检测食管鳞癌EC9706和Eca109细胞中IκBα、磷酸化IκBα(pIκBα)、p50和p65蛋白的表达及0、50、100和200μmol/L辣椒素作用后pIκBα和Bcl-2蛋白的表达;凝胶滞留实验检测2种食管鳞癌细胞胞核中NF-κB与DNA的结合活性及0、100和200μmol/L辣椒素作用对NF-κB与DNA结合活性的影响。2种食管鳞癌细胞分别分为对照组、5-FU组、辣椒素组和联合组,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。结果:2种食管鳞癌细胞胞质均表达IκBα和pIκBα蛋白,胞核均表达p50和p65蛋白;随辣椒素作用浓度的增加,pIκBα和Bcl-2蛋白的表达逐渐下降,NF-κB与DNA的结合活性也逐渐下降。辣椒素可促进2种食管鳞癌细胞的凋亡,与5-FU联合使用时,凋亡细胞显著增加(EC9706:F辣椒素=2535.497,F交互=113.034,P<0.001;Eca109:F辣椒素=5984.040,F交互=5.150,P<0.05)。结论:辣椒素可能通过抑制IκBα的磷酸化阻断NF-κB信号通路,促进食管鳞癌细胞凋亡。

EC9706,Eca109细胞系中S100A4及基质金属蛋白酶-2的表达

目的:检测食管鳞状细胞癌EC9706、Eca109细胞系中S100A4及基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的表达。方法:采用免疫细胞化学法和Western blotting法检测EC9706、Eca109中S100A4蛋白及MMP-2蛋白的表达,采用RT-PCR法检测EC9706和Eca109细胞中S100A4与MMP-2的mRNA表达。结果:EC9706、Eca109细胞系中均存在S100A4与MMP-2蛋白及mRNA的表达,S100A4蛋白及MMP-2蛋白的阳性表达主要定位于胞浆中,Eca109细胞系中偶见胞核着色。Eca109细胞系中S100A4与MMP-2蛋白和S100A4 mRNA的表达量高于EC9706(P<0.05)。结论:在EC9706、Eca109细胞系中均有S100A4、MMP-2的表达,提示S100A4可能在食管鳞状细胞癌的发生、发展中起重要作用。

食管癌与微小RNA关系研究进展

食管癌（EC）是世界恶性肿瘤和癌症死亡的常见原因[1]。尽管EC的诊断和治疗已得到快速发展,但其平均5年生存率仅保持在10%~20%[2]。评估EC预后和建立合理的治疗方案显得十分重要。因此,有必要找到食管癌的肿瘤分子标志物。人类基因组计划结束后,人们发现编码蛋白质的基因只占总基因组的2%。

木犀草苷对人食管鳞状癌Eca109细胞生长的抑制作用及其机制

目的研究木犀草苷对人食管鳞状癌Eca109细胞生长的抑制作用及其机制。方法 Eca109细胞经不同浓度木犀草苷处理后,MTT法检测Eca109细胞增殖;倒置显微镜观察Eca109细胞形态的变化;流式细胞术检测Eca109细胞周期变化及细胞凋亡情况;RT-PCR检测Eca109细胞cyclin D1、survivin和c-myc基因表达。结果 MTT实验表明,木犀草苷80、120、160、200、240μmol/L对Eca109细胞均有抑制作用,且与浓度相关。木犀草苷可引起Eca109细胞形态改变、体积缩小,并与周围细胞脱离,浓度为240μmol/L时使细胞呈出芽状,有的细胞伸出多个伪足样突起;浓度为160、240μmol/L时,可将细胞阻滞于G2/M期,诱导细胞凋亡;浓度为240μmol/L并处理Eca109细胞48 h后,使Eca109细胞cyclin D1、survivin和c-myc基因表达低于对照组(P<0.05)。结论木犀草苷对食管鳞状癌Eca109细胞的生长有显著抑制作用,其通过改变细胞周期、诱导细胞凋亡及抑制相关基因的表达发挥抗肿瘤作用。

THP-1来源的M1型巨噬细胞对食管鳞癌细胞的凋亡、增殖与迁移作用

THP-1细胞经LPS和IFN-γ活化诱导为经典激活的M1型巨噬细胞。M1型巨噬细胞在肿瘤发生的初期发挥着重要的作用,能够识别并清除肿瘤细胞,但对食管鳞癌细胞Eca109的具体调节作用尚不清楚。本研究利用THP-1细胞来源的M1型巨噬细胞与食管鳞癌细胞Eca109共培养的模型;用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测TNF-α和IL-1β mRNA的表达;用流式细胞技术、Transwell实验检测M1型巨噬细胞与食管鳞癌细胞Eca109共培养24 h后对Eca109细胞凋亡、增殖与迁移的影响。结果显示,诱导后的THP-1细胞完全贴壁并有伪足出现;与M0细胞相比,诱导的M1型巨噬细胞相关细胞因子TNF-α、IL-1β的mRNA表达均显著增高(P<0.01);与M1型巨噬细胞共培养后可以促进食管鳞癌细胞的凋亡(P<0.01)、抑制食管鳞癌细胞的增殖(P<0.01)与迁移(P<0.001)。本研究结果提示,THP-1来源的M1型巨噬细胞与食管鳞癌细胞Eca109共培养可以促进食管鳞癌细胞Eca109的凋亡,抑制其增殖与迁移。

开环Ebselen衍生物的合成、晶体结构及抑癌活性

以2-氯硒基苯甲酰氯(1)为原料,通过缩合反应,合成得到开环Ebselen衍生物1a~d,其结构经^(1)H NMR,^(13)C NMR和HR-MS(ESI)表征,采用XRD测定其单晶结构。单晶X射线衍射结果表明,化合物1a~1c属于单斜晶系,P2_(1)/n空间群;化合物1d属于正交晶系,P2_(1)2_(1)2_(1)空间群。并通过MTT法考察了这些化合物对食管癌细胞(EC109)的体外增殖抑制活性。结果表明,在浓度为100μg·mL^(-1)时,化合物1c具有较强的抑制EC109细胞增殖的活性,抑制率为29.55%。

TPX2-siRNA对裸鼠体内移植瘤生长及TPX2表达的影响

我们通过建立裸鼠食管鳞癌细胞EC9706的移植瘤模型，观察TPX2干扰前后对移植瘤的影响和肿瘤组织中TPX2的表达水平。