多种肿瘤干细胞标志物在食管鳞癌TE-1细胞系中的表达

目的:检测食管鳞癌TE-1细胞系中肿瘤干细胞标志物CD44、CD133、P75NTR、OCT-4的表达,探讨食管鳞癌的肿瘤干细胞标志物。方法:应用免疫荧光技术检测食管鳞癌TE-1细胞系中CD44、CD133、P75NTR、OCT-4的表达和定位。结果:在TE-1细胞中,CD44和CD133在所有细胞都表达且荧光定位在细胞的胞浆;P75NTR和OCT-4也在所有细胞表达,但在有些细胞荧光定位于胞核,在另外一些细胞荧光定位于胞浆。结论:在TE-1中可能存在肿瘤干细胞,但CD44、CD133、P75NTR、OCT-4不是特异的标志物。

沉默GLUT-1表达对食管鳞癌细胞株TE-13增殖和迁移的影响

目的研究沉默葡萄糖转运蛋白-1(glucose transporter protein-1,GLUT-1)的表达对食管鳞癌TE-13细胞增殖、周期及迁移的影响及可能的作用机制。方法采用慢病毒感染的方法将特异性针对GLUT-1基因的GLUT-1-sh RNA转入TE-13细胞,建立稳定干扰GLUT-1表达的TE-13细胞株,分成GLUT-1-sh RNA组和阴性对照组进行对比研究。采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测GLUT-1-sh RNA对TE-13细胞GLUT-1 m RNA及其蛋白表达的影响。CCK-8法、FCM法和Transwell小室迁移实验分别检测沉默GLUT-1表达后对TE-13细胞增殖、细胞周期和迁移的影响;同时采用蛋白质印迹法检测细胞迁移以及乏氧相关蛋白的表达情况。结果采用慢病毒将GLUT-1-sh RNA转入TE-13细胞后,可明显下调GLUT-1蛋白(t=6.713,P<0.01)和m RNA的表达水平(t=4.181,P<0.05)。与阴性对照组相比,GLUT-1干扰后细胞的增殖至72 h(t=3.097,P<0.05)和96 h(t=3.497,P<0.05)明显被抑制,同时细胞的迁移能力可见下降,但是细胞周期至24 h未见影响;基质金属蛋白酶的MMP-9(t=6.895,P<0.01)和缺氧诱导因子HIF-1α(t=13.74,P<0.001)的表达明显下调,但是MMP-2的表达没有变化(t=2.582,P>0.05)。结论沉默GLUT-1的表达可抑制食管磷癌细胞株TE-13细胞的增殖和迁移,并明显下调细胞内MMP-9和HIF-1α蛋白的表达,为寻找靶向治疗食管癌新靶点提供了初步的实验基础。

POFUT1影响食管鳞癌细胞生物学行为及其机制的初步研究

目的探讨蛋白O-岩藻糖基转移酶1(POFUT1)对食管鳞癌细胞增殖、迁移、周期和凋亡的影响及其潜在机制。方法利用siRNA转染人食管鳞癌细胞KYSE30和EC109细胞株,按转染情况分为POFUT1敲低组(转染POFUT1 siRNA)和阴性对照组(转染NC siRNA)。应用实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)和蛋白质印迹法验证敲低效果。通过CCK-8法、Transwell实验检测不同的POFUT1表达对细胞增殖、迁移能力的影响;采用流式细胞术检测敲低POFUT1后食管鳞癌细胞周期和凋亡的变化。通过转录组测序分析POFUT1敲低组与阴性对照组KYSE30细胞中的差异表达基因,利用KEGG数据库分析潜在的信号通路。结果与阴性对照组相比,POFUT1敲低组细胞增殖能力及迁移细胞数均明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。与阴性对照组相比,POFUT1敲低组凋亡细胞比例增加,同时,细胞周期G2/M期细胞比例增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。转录组测序分析及qRT-PCR结果显示,敲低POFUT1后,多条癌症相关信号通路分子表达发生改变,其中鞘脂信号通路相关基因S1PR5与MAPK8,以及NOTCH信号通路相关基因NOTCH1、NOTCH2、DLL1表达均降低。结论POFUT1体外敲低导致食管鳞癌细胞增殖和迁移减少、细胞周期阻滞以及凋亡水平升高,POFUT1可能通过鞘脂信号通路、NOTCH信号通路等影响食管鳞癌细胞生物学行为。

IL-10受体沉默的树突状细胞瘤苗对食管鳞癌细胞体内外免疫活性的影响

目的探讨IL-10受体(IL-10R)沉默的树突状细胞(DC)瘤苗对食管鳞癌细胞体内外免疫活性的影响。方法从食管鳞癌患者外周血中提取DC,使用倒置显微镜和扫描电镜对DC细胞形态进行鉴定,流式细胞仪上机检测DC细胞的表型。将TE11细胞分为空白对照组、DC-CTL组、NC-shRNA-DC-CTL组和IL-10R-shRNA-DC-CTL组。制作负载热休克凋亡的TE11细胞抗原的DC,然后使用Lipofectamine 3000分别进行IL-10R-shRNA慢病毒和NC-shRNA慢病毒转染,最后通过不同处理的DC诱导特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。通过MTT法检测DC对TE11细胞的杀伤率,采用ELISA法检测TE11细胞培养上清液中IL-12和干扰素(IFN)-γ含量。将荷瘤小鼠随机分为对照组、未转染的DC组(DC组)、NC-shRNA-DC组和IL-10R-shRNA-DC组,每组6只。将DC悬液或生理盐水注射至小鼠淋巴结,每周注射1次,共注射4次。每隔7 d用游标卡尺测量肿瘤体积。采用免疫组织化学染色检测肿瘤组织中Ki67表达水平,TUNEL染色检测肿瘤组织TUNEL阳性率,流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞中CD8^(+)T细胞的比例,采用ELISA法检测肿瘤组织中IL-12和IFN-γ水平,采用RT-qPCR检测肿瘤组织中IL-10 mRNA和IL-10R mRNA水平。采用Western blot检测肿瘤组织中IL-10、IL-10R、信号转导子和转录激活子3(STAT3)、p-STAT3、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)和程序性死亡配体1(PD-L1)的蛋白表达水平。结果倒置显微镜和扫描电镜证实分离的细胞符合DC形态学,DC的特异性标志物CD11c、MHC-Ⅱ、HLA-DR和CD83的阳性率分别为91.43%,89.53%,88.62%和90.74%。与空白对照组相比,DC-CTL组、NC-shRNA-DC-CTL组和IL-10R-shRNA-DC-CTL组TE11细胞杀伤率升高(P<0.05),TE11细胞培养上清液中IL-12和IFN-γ的水平升高(P<0.05);与DC-CTL组和NC-shRNA-DC-CTL组相比,IL-10R-shRNA-DC-CTL组TE11细胞杀伤率升高(P<0.05),TE11细胞培养上清液中IL-12和IFN-γ的水平升高(P<0.05)。与对照组相比,DC组、NC-shRNA-DC组和IL-10R-shRNA-DC组大鼠肿瘤体积和Ki67阳性率降低(P<0.05),TUNEL阳性率升高(P<0.05),肿瘤浸润淋巴细胞中CD8^(+)T细胞比例及肿瘤组织中IL-12和IFN-γ的水平升高(P<0.05),肿瘤组织中IL-10和IL-10R mRNA和蛋白水平、STAT3磷酸化水平以及PD-1和PD-L1蛋白水平降低(P<0.05);与DC组和NC-shRNA-DC组相比,IL-10R-shRNA-DC组肿瘤体积和Ki67阳性率降低(P<0.05),TUNEL阳性率升高(P<0.05),肿瘤浸润淋巴细胞中CD8^(+)T细胞比例及肿瘤组织中IL-12和IFN-γ的水平升高(P<0.05),肿瘤组织中IL-10和IL-10R mRNA和蛋白水平、STAT3磷酸化水平以及PD-1和PD-L1蛋白水平降低(P<0.05)。结论IL-10R沉默的DC瘤苗具有体内外抗食管鳞癌活性,可有效增强CD8^(+)T细胞免疫活性,抑制STAT3激活以及PD-1/PD-L1免疫检查点。

肿瘤微环境下肿瘤转移相关蛋白1在食管鳞癌上皮细胞间质化和转移机制研究

目的探究肿瘤微环境(TME)下肿瘤转移相关蛋白1(MTA1)表达情况及其在食管鳞癌上皮细胞间质化(EMT)和转移机制,为今后临床治疗食管鳞癌提供思路。方法采用实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)技术测定并比较人正常食管上皮细胞及不同类型食管鳞癌细胞中MTA1 mRNA表达情况;选择表达量最高的食管鳞癌细胞株用于构建敲低MTA1表达的食管鳞癌细胞系KYSE410细胞(siMTA1组),同时构建正常MTA1表达的KYSE410细胞(siNC组);分析TME培养对siMTA1组与siNC组KYSE410细胞中MTA1 mRNA表达的影响;在TME培养下,采用超敏型细胞增殖检测试剂(CCK-8)检测siMTA1组与siNC组KYSE410细胞增殖情况;Transwell小室试验检测siMTA1组与siNC组KYSE410细胞侵袭与转移情况、RT-qPCR法检测siMTA1组与siNC组KYSE410细胞EMT上皮性钙黏附蛋白(E-cad)、神经型钙黏附蛋白(N-cad)mRNA相对表达量。结果食管鳞癌细胞株(KYSE30、KYSE150、KYSE410、KYSE450)的MTA1 mRNA表达量均高于人正常食管上皮细胞HET-1A,且KYSE410细胞株表达量最高;常规培养、TME下siNC组MTA1 mRNA相对表达量均高于siMTA1组;与常规培养比,TME培养下siNC组、siMTA1组MTA1 mRNA相对表达量均较高;TME培养条件下,siNC组KYSE410细胞侵袭数量、转移数量均高于siMTA1组;TME培养条件下,siNC组KYSE410细胞EMT相关分子E-cad mRNA相对表达量低于siMTA1组,N-cad mRNA相对表达量高于siMTA1组(均P<0.05)。结论食管鳞癌细胞中MTA1 mRNA表达量较人正常食管上皮细胞明显增加,且相较于常规培养条件,TME培养条件下会显著促进MTA1的表达,MTA1的敲低明显调节EMT相关分子的表达,抑制KYSE410细胞的增殖、侵袭、转移。

莪术醇β-环糊精包合物对食管癌TE-1细胞增殖、凋亡的影响及其机制研究

目的探讨莪术醇β-环糊精包合物对食管癌TE-1细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法采用饱和溶液法制备莪术醇与β-环糊精的包合物,红外光谱验证包合物的形成。不同浓度(25、50、100mg/L)莪术醇β-环糊精包合物处理食管癌TE-1细胞后,噻唑蓝[3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide,MTT]比色法测定细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期与凋亡情况。实时荧光定量PCR及2-ΔΔCt法定量分析不同处理组Survivin mRNA的相对表达量。Western blot检测Survivin蛋白表达。结果 MTT法检测结果显示,与对照组比较,莪术醇β-环糊精包合物各剂量组生长抑制率均明显升高,且随着剂量升高而增加,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测结果显示,莪术醇β-环糊精包合物处理可使细胞阻滞在G0/G1期与G2/M期,并且促进细胞凋亡。此外,与对照组比较,处理组细胞中Survivin mRNA与蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论莪术醇β-环糊精包合物能够抑制食管癌细胞TE-1的增殖,促进凋亡,对Survivin的抑制与其抑制食管癌细胞的恶性表型的作用相关。

温郁金提取物对食管癌TE-1细胞增殖的抑制作用

目的研究温郁金提取物对食管癌TE-1细胞增殖的抑制作用。方法采用超临界CO2萃取法提取温郁金成分。将TE-1细胞贴壁后分成4组:1组加入100μL含0.1%DMSO的RMPI-1640培养基,作为对照组;另外3组分别加入浓度为25、50、100mg/L温郁金提取物完全培养液各100μL,分别作为温郁金低、中、高剂量组。培养48h后采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定各组TE-1细胞生长抑制率。应用基因芯片技术检测各组TE-1细胞基因表达谱的变化。对差异表达基因进行基因本体(gene ontology,GO)功能分类。结果与对照组比较,温郁金各剂量组生长抑制率均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。温郁金各剂量组TE-1细胞生长抑制率随着剂量升高而增加,差异均有统计学意义(P<0.05)。通过基因芯片筛选出温郁金提取物作用前后88个基因表达水平发生改变且有统计学意义,包括22个基因表达下调,66个基因表达上调。基因GO分类提示差异表达基因主要涉及信号传导(6个)、细胞周期(8个)、凋亡(14个)或分化调节(10个)等。结论温郁金提取物对人食管癌TE-1细胞生长有抑制作用,其抗肿瘤作用可能与调控多层次的基因表达改变有关。

顺铂降低铜离子转运蛋白1表达诱导人食管鳞癌细胞耐药

目的诱导对顺铂耐药的人食管鳞癌细胞株,并进一步研究细胞耐药性产生的机制。方法逐渐增加顺铂浓度处理人食管鳞癌细胞HKESC-1,诱导顺铂耐药细胞株HKESC-1/cis。MTT法观察顺铂的细胞毒作用以及细胞的生长曲线。电感耦合等离子体质谱检测细胞内顺铂的蓄积和Pt-DNA加合物的形成。Western blot检测铜离子转运蛋白(copper transporter 1,CTR1)的表达。结果顺铂耐药细胞株HKESC-1/cis较其亲代细胞HKESC-1对顺铂引起的细胞毒作用敏感性下降,耐药指数为2.9。顺铂耐药细胞株HKESC-1/cis与其亲代细胞HKESC-1的生长速度相似。然而,HKESC-1/cis细胞内顺铂蓄积和Pt-DNA加合物的形成较HKESC-1细胞减少,并且CTR1蛋白表达水平降低。结论顺铂通过降低细胞膜CTR1蛋白的表达,抑制顺铂进入细胞,导致细胞耐药性的产生。

过表达miR-145-5p通过下调IGF1R抑制食管鳞状细胞TE-10细胞的恶性生物学行为

目的:探究miR-145-5p对食管鳞状细胞癌TE-10细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)等恶性生物学行为的分子机制。方法:q PCR法检测miR-145-5p在食管鳞状细胞癌细胞和正常食管上皮细胞中的表达水平。采用双荧光素酶报告基因实验检测miR-145-5p与胰岛素样生长因子1受体(insulin-like growth factor 1 receptor,IGF1R)的靶向调控关系,Western blotting检测IGF1R蛋白和EMT相关蛋白的表达,CCK-8法和Transwell检测miR-145-5p/IGF1R分子轴对TE-10细胞增殖、侵袭、迁移的影响。结果:miR-145-5p在3株食管鳞状细胞癌细胞中低表达且在TE-10细胞中表达最低(P<0.01或P<0.05)。过表达miR-145-5p可显著抑制TE-10细胞的增殖、侵袭、迁移和EMT进程(P<0.01或P<0.05)。双荧光素酶报告基因证实miR-145-5p靶向下调IGF1R表达(P<0.01)。回复实验进一步证实,与单独过表达IGF1R相比,同时过表达miR-145-5p和IGF1R能显著缓解IGF1R对TE-10细胞的增殖、侵袭、迁移和EMT进程的促进作用(P<0.01或P<0.05)。结论:过表达miR-145-5p通过靶向下调IGF1R进而抑制了食管鳞状细胞癌TE-10细胞的增殖、侵袭、迁移和EMT进程。

长链非编码RNA淋巴细胞白血病缺失基因1在食管鳞癌中的表达及其对细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的分析长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)淋巴细胞白血病缺失基因1(deleted in lymphocytic leukemia 1,DLEU1)在食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)中的表达及意义,并进一步研究DLEU1对ESCC细胞TE-13增殖、迁移和侵袭的影响。方法采用实时荧光定量PCR检测ESCC组织和癌旁组织中DLEU1的表达。通过CCK-8、划痕试验和Transwell侵袭试验分析DLEU1表达对TE-13增殖、迁移和侵袭的影响。结果DLEU1在ESCC癌组织中的表达较癌旁组织明显升高(P<0.05)。DLEU1的表达与淋巴结转移和TNM分期相关(P<0.05),而与患者的年龄、性别、分化程度和浸润深度均无关(P>0.05)。生存分析示,DLEU1高表达ESCC患者的生存时间较低表达患者明显缩短(P<0.05)。干扰DLEU1表达后TE-13的增殖、迁移和侵袭能力显著受抑。结论DLEU1在ESCC中表达上调,DLEU1的高表达提示预后不良,DLEU1可能对ESCC细胞TE-13的增殖、迁移和侵袭具有调节作用,DLEU1有可能成为ESCC治疗的潜在靶点。

人食管癌细胞株KYSE-150、TE-1中肿瘤干细胞的培养分化及增殖侵袭能力分析

背景:研究发现,食管癌组织中存在一类细胞亚群,具有一定的侵袭和转移性能,与治疗效果之间存在十分密切的联系。目的:从人食管癌细胞株KYSE-150、TE-1中分离富含肿瘤干细胞的细胞球,并对其增殖和侵袭能力进行分析。方法:运用无血清培养基培养KYSE-150、TE-1细胞,观察细胞球的生成情况,采用MTT法以及Transwell小室实验检测细胞的增殖情况和侵袭能力,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达。结果与结论:①KYSE-150、TE-1细胞在无血清培养条件下可以获得稳定传代的细胞球。②细胞球的增殖能力和侵袭能力均显著高于亲本细胞(P<0.05)。③TE-1细胞球和KYSE-150细胞球的CD44^+、CD271^+、CD44^+CD271^+细胞比例均显著高于TE-1亲本细胞和KYSE-150亲本细胞(P<0.05)。④实验结果提示,从人食管癌细胞株KYSE-150、TE-1中分离出具有肿瘤干细胞特性的细胞球,具有很强的增殖和侵袭转移能力,且CD44和CD271可以作为重要的食管癌干细胞表面标志物。

放疗对食管鳞癌患者血清SCC、CEA、CRFRA21-1、TAG72、CA199、T淋巴细胞亚群的影响

目的:探讨放疗对食管鳞癌患者血清鳞状上皮细胞癌抗原(squamous cell cancer,SCC)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)、细胞角蛋白19片段抗原21-1(cytokerantin-19-fragment antigen21-1,CRFRA21-1)、肿瘤相关糖蛋白72(tumor associated glycoprotein,TAG72)、糖类抗原199(cancer antigen 199,CA199)水平及T淋巴细胞亚群的影响。方法:选择2013年1月~2016年1月在江阴市人民医院确诊的60例食管鳞癌患者为实验组,另外同期选择40例健康体检者为对照组。实验组患者给予6MV X线放射治疗。检测并比较实验组患者放疗前和放疗后1个月、对照组健康者血清SCC、CEA、CRFRA21-1、TAG72、CA199水平及外周血CD4+、CD8+细胞所占的比值。结果:治疗前,实验组患者血清SCC、CEA、CRFRA21-1水平均明显高于对照组健康者,差异具有统计学意义(均P<0.05);治疗后,实验组患者血清SCC、CEA、CRFRA21-1水平均明显低于治疗前,但实验组患者上述各肿瘤标志物水平均明显高于对照组健康者,差异具有统计学意义(均P<0.05)。治疗前,实验组患者外周血CD4^+、CD4^+/CD8^+所占比值明显低于对照组健康者,CD8^+细胞所占比值明显高于对照组健康者,差异具有统计学意义(均P<0.05);治疗后,实验组患者外周血CD4^+、CD8^+细胞所占比值及CD4^+/CD8^+比值与治疗前比较差异无统计学意义(均P>0.05),且实验组患者外周血CD4^+、CD4^+/CD8^+细胞所占比值明显低于对照组健康者,CD8^+比值明显高于对照组健康者,差异具有统计学意义(均P<0.05)。结论:放疗能明显降低食管鳞癌患者血清SCC、CEA、CRFRA21-1、水平,但对T淋巴细胞亚群水平影响不明显。

IL-1β通过STAT3信号通路上调食管鳞癌细胞PD-L1表达的研究

目的探讨促炎细胞因子白介素1β(IL-1β)对食管鳞癌细胞程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)的表达调控作用及调控机制,阐明IL-1β在食管鳞癌肿瘤微环境中调控PD-L1表达的临床意义。方法分析TCGA数据中收录的有关食管癌中IL-1β和PD-L1表达的数据,明确IL-1β和PD-L1在食管癌中的表达及预后意义;在体外细胞系水平,运用重组的人源化IL-β蛋白刺激食管鳞癌细胞系KYSE30后,运用qRT-PCR检测PD-L1的mRNA表达,运用免疫印迹和免疫荧光实验技术检测PD-L1蛋白表达;为了明确IL-β的作用信号通路,运用抗体芯片筛选重组的人源化IL-β蛋白处理和未处理食管癌细胞内的信号通路差异。结果生物信息学分析显示,相比癌旁正常组织IL-1β和PD-L1在食管癌组织中显著性上调表达;但上调的IL-1β和PD-L1表达与食管癌患者的总生存差具有统计学趋势但不具有统计学相关性。重组的人源化IL-β蛋白刺激食管鳞癌细胞系后,能显著性上调PD-L1的mRNA和蛋白表达。抗体芯片筛选结果显示,重组的人源化IL-β蛋白处理食管癌细胞后,能显著性激活STAT3信号通路。结论IL-1β通过STAT3信号通路上调食管鳞癌细胞PD-L1表达。

miR-34a靶向调控Sirtuin 1表达对食管鳞癌细胞侵袭、转移的影响

目的探讨miR-34a靶向调控去乙酰化酶1(Sirtuin 1)表达对食管鳞癌细胞侵袭、转移的影响。方法采用miRNAs靶标预测软件、Target Scan Human5.1生物在线工具预测Sirtuin 1可能是miR-34a的靶基因。将体外培养的人食管鳞癌细胞EC9706分别转染miR-34a mimic(EC9706/miR-34a组)、miR-34a scramble(EC9706/scramble组),转染48 h后收集细胞,采用Western blotting法检测Sirtuin 1蛋白表达、Transwell侵袭试验检测穿膜细胞数、细胞划痕实验检测细胞划痕愈合率。将裸鼠随机分为对照组和miR-34a组,分别经尾静脉注射转染miR-34a scramble和转染miR-34a agomir的EC9706细胞悬液,接种8周后处死裸鼠,取出双肺,计数肺转移瘤数量。结果 EC9706/miR-34a组及EC9706/scramble组细胞Sirtuin 1蛋白相对表达量分别为0.75±0.07、1.90±0.06,穿膜细胞数分别为(123.00±8.89)、(203.33±5.86)个,细胞划痕愈合率分别为(33.67±2.08)%、(64.00±2.65)%,两组比较P均<0.01。miR-34a组和对照组裸鼠形成肺转移瘤分别为(4.67±0.82)、(8.83±1.17)个,两组比较P<0.01。结论 Sirtuin 1是miR-34a的靶基因。miR-34a通过靶向抑制Sirtuin 1蛋白表达抑制食管鳞癌EC970细胞的侵袭、转移。

下调DNMT1对食管鳞癌EC9706细胞增殖、迁移的影响及相关机制的研究

背景与目的:已有研究显示在多种肿瘤组织或细胞中均能检测出特异性DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)的高表达,提示DNMT1的高表达与肿瘤的发生发展密切相关。本研究旨在通过下调DNMT1基因的表达,研究其对食管鳞癌EC9706细胞的增殖及浸润转移能力的影响,并探讨相关的分子作用机制。方法:利用CCK-8试剂盒研检测下调DNMT1对EC9706细胞增殖能力的影响,并利用Boyden室法检测下调DNMT1对EC9706细胞浸润转移能力,进一步通过Real-time PCR和Western印迹法检测转染DNMT1 siRNA后细胞中DNMT1及MMP-2基因的转录及其蛋白表达。结果:DNMT1 siRNA转染后,能明显抑制食管鳞癌EC9706细胞的增殖,降低其浸润转移能力,引起MMP-2表达下调,提示DNMT1下调引起的浸润转移能力的降低可能与MMP-2表达下调密切相关。结论:DNMT1可能成为食管鳞癌治疗新的分子靶点。

半乳糖凝集素1表达下调对食管鳞癌细胞周期及迁移能力的影响及机制

目的观察半乳糖凝集素1(Galectin-1)表达下调对食管鳞癌细胞周期及迁移能力的影响及机制。方法利用脂质体2000转染食管鳞癌EC9706细胞。细胞分为3组,即未处理组、对照siRNA组和Galectin-1 siRNA组。采用半定量RT-PCR、免疫细胞化学检测各组食管鳞癌EC9706细胞中Galectin-1 mRNA和蛋白的表达;运用流式细胞术分析Galectin-1表达下调对食管鳞癌细胞周期的影响,采用Boyden小室分析Galectin-1表达下调对食管鳞癌细胞迁移能力的影响。采用半定量RT-PCR和Western印迹方法检测Galectin-1表达下调对细胞周期相关因子(cdk2、p27和p21)以及细胞迁移相关因子基质金属蛋白酶(MMP)-14 mRNA和蛋白的表达水平的变化。结果 Galectin-1 siRNA组与未处理组和对照siRNA组相比,Galectin-1 siRNA组中Galectin-1 mRNA和蛋白的表达均显著下调(P<0.05);细胞周期在G0/G1期的细胞数呈显著升高(P<0.05);细胞的穿膜数明显下降。Galectin-1 siRNA组中p27和p21 mRNA和蛋白的表达均显著高于未处理组和对照siRNA组(均P<0.05),而cdk2和MMP-14 mRNA和蛋白的表达均显著低于未处理组和对照siRNA组(均P<0.05)。结论 Galectin-1 siRNA能有效下调食管鳞癌EC9706细胞中Galectin-1 mRNA和蛋白的表达;Galectin-1表达下调能明显抑制食管癌EC9706细胞周期静止在G0/G1期,这可能与p21和p27表达的升高及cdk2表达的下调密切相关;并能降低食管鳞癌EC9706细胞的迁移,这可能与MMP-14表达的下调有关。

食管鳞癌Cyclin D1与细胞增殖关系的研究及意义

目的 探讨食管鳞癌细胞中细胞周期素D1(CyclinD1)表达与细胞增殖的关系及意义。方法 应用免疫组织化学和流式细胞术检测 48例食管鳞癌组织中CyclinD1蛋白表达及DNA倍体、S期细胞比值、G2 /M期细胞比值。结果 48例食管鳞癌中CyclinD1阳性表达率为 45 8%(2 2 / 48) ;DNA异倍体检出率为 5 0 %(2 4/ 48) ,CyclinD1阳性表达的标本中DNA异倍体的检出率为 6 8 2 %(15 / 2 2 ) ,显著高于CyclinD1阴性表达的标本 (33 3%,9/ 2 7,P <0 0 5 )。CyclinD1表达阳性的肿瘤中细胞周期G2 /M期的比值也明显高于CyclinD1表达阴性的肿瘤 (分别为 5 98± 4 87和 4 12± 2 70 ,P<0 0 5 )。结论 从观察结果推测CyclinD1的表达可以加速肿瘤细胞增殖。分析食管鳞癌CyclinD1、DNA倍体及不同时相的细胞增殖有助于帮助分析和判断病人的预后。

鸦胆子油乳剂对食管鳞状细胞癌TE-1细胞增殖、凋亡和自噬的影响及其可能的机制

目的:探讨鸦胆子油乳剂(BJOE)对食管鳞状细胞癌TE-1细胞增殖、凋亡和自噬的影响及其可能的机制。方法:按干预措施的不同,将TE-1细胞分为对照组、RAPA(自噬激动剂)组、740Y-P(PI3K激活剂)组、BJOE组、BJOE+RAPA组和BJOE+740Y-P组。采用FCM、克隆形成、Transwell实验检测细胞凋亡、增殖、迁移和侵袭能力,qPCR法检测细胞中PI3K、Akt、mTOR、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p62、Beclin 1、caspase-3的mRNA表达,WB法检测PI3K、Akt、mTOR及其磷酸化、LC3Ⅱ/Ⅰ、p62、Beclin 1、caspase-3的蛋白表达。结果:与对照组比较,RAPA组和BJOE组细胞凋亡率均显著升高(均P<0.01),细胞克隆形成率、迁移和侵袭能力均显著降低(均P<0.01),细胞中PI3K、Akt、mTOR的mRNA和蛋白磷酸化水平均显著降低(均P<0.05),p62的mRNA和蛋白水平显著降低(均P<0.01),LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1和caspase-3的mRNA和蛋白水平显著升高(均P<0.05),740Y-P组的结果则相反(均P<0.05);与RAPA组或740Y-P组比较,BJOE+RAPA组或BJOE+740Y-P组细胞凋亡率显著升高(均P<0.01),克隆形成率、细胞侵袭和迁移能力显著降低(均P<0.01),PI3K、Akt、mTOR的mRNA和蛋白磷酸化水平均显著降低(均P<0.05),p62的mRNA和蛋白水平均显著降低(均P<0.05),LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin 1和caspase-3 mRNA和蛋白水平显著升高(均P<0.05)。结论:BJOE显著抑制TE-1细胞增殖、迁移、侵袭并促进细胞凋亡与自噬,其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活有关。

表皮生长因子对食管鳞癌细胞Eca109细胞周期及其调控因子的影响

目的:探讨表皮生长因子(EGF)对食管鳞癌细胞Eca109细胞周期及相关调控因子的影响。方法:20 ng/ml重组人EGF(rh EGF)作用于血清饥饿的Eca109细胞24 h,采用流式细胞术检测EGF对Eca109细胞周期的影响,实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测p21CIP1/WAF1(p21)、p27KIP1(p27)mRNA的表达情况,Western blot检测p21、p27蛋白的表达情况。结果:EGF组和对照组G1期细胞所占比例分别为(54.90±0.82)%和(65.94±0.74)%(P<0.01);qRTPCR结果显示p21 mRNA表达水平EGF组明显高于对照组,p27 mRNA表达水平EGF组明显低于对照组(P<0.01);Western blot结果显示,p21蛋白表达水平EGF组明显高于对照组,p27蛋白表达水平EGF组明显低于对照组(P<0.01)。结论:EGF有利于Eca109细胞从G1期过渡到S期,促进细胞增殖,可能与调节p21、p27的mRNA和蛋白的表达相关。

白杨素通过调控miR-199a-3p/ZHX1抑制食管鳞癌细胞增殖和侵袭

目的:探究白杨素(Chrysin,CR)对食管鳞癌细胞增殖和侵袭的影响及其潜在的分子机制。方法:将食管鳞癌细胞分为对照组(未转染、未CR处理细胞常规培养)、miR-NC组(稳定转染的miR-199a-3p-NC用等量DSMO培养)、miR mimic组(稳定转染的miR-199a-3p mimic用等量DSMO培养)、CR-miR-NC组(稳定转染的miR-199a-3p-NC用终浓度100μmol·L-1CR培养)、CR-miR mimic组(稳定转染的miR-199a-3p mimic用终浓度100μmol·L-1CR培养),48 h后,采用流式细胞仪检测转染效率,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测EC9706细胞中miR-199a-3p和锌指和同源框蛋白1(Zinc-fingers and homeoboxes protein 1,ZHX1)表达情况,采用荧光素活性和蛋白免疫印迹(Western blot)检测miR-199a-3p对ZHX1的调控作用,分别采用MTT和transwell小室实验检测EC9706细胞增殖和侵袭能力。结果:流式细胞仪检测结果显示转染效率达到80%以上;CR-miR-NC组miR-199a-3p的表达水平显著低于miR-NC组(P<0.05);CR-miR mimic组miR-199a-3p的表达水平显著低于miR mimic组(P<0.05),CR-miR-NC组ZHX1的表达水平显著高于miR-NC组(P<0.05);CR-miR mimic组ZHX1的表达水平显著高于miR mimic组(P<0.05)。荧光素酶活性测定显示,在转染ZHX1 3’UTR的细胞中,与miR-199a-3p-NC组相比,miR-199a-3p mimic组荧光素酶活性显著降低(P<0.05),而在转染ZHX13’UTR-Mut的细胞中,miR-199a-3p mimic组与miR-199a-3p-NC组的荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05),CR-miR-NC组EC9706细胞增殖和侵袭能力显著低于miRNC组(P<0.05),CR-miR mimic组EC9706细胞增殖和侵袭能力显著低于miR mimic组(P<0.05)。结论:CR通过调控miR-199a-3p/ZHX1抑制食管鳞癌细胞增殖和侵袭,为食管鳞癌的靶向治疗提供一定的理论依据。