定点饱和突变提高赭曲霉11α羟化酶的催化性能

【目的】11α,17α-双羟基黄体酮是重要的甾体激素类药物中间体,应用价值大。赭曲霉(Aspergillus ochraceus)CICC 41473的11α羟化酶CYP68J5是转化17α-羟基黄体酮生成11α,17α-双羟基黄体酮的关键酶,但其催化性能有待于提升。【方法】在课题组前期确定的关键氨基酸位点D118、F216和M488基础上,通过定点饱和突变和底物转化实验进行优良突变体的筛选;使用AutoDock进行酶与底物的分子对接,并通过Discovery Studio和Gromacs分别研究分子间相互作用力和分子动力学模拟。【结果】突变体D118V、F216W、M488L和M488W具有催化性能,其中,优良突变体D118V的活性最高,其在底物浓度0.5 g/L时,生产强度为431.66 mg/(L·d),较野生型提高了2.12倍,这可能是因为当118位的天冬氨酸突变为缬氨酸后,该位点与底物之间产生了新的疏水相互作用,增强了酶的底物结合口袋的疏水性。分子动力学模拟结果表明酶的整体构象更稳定,酶与底物的结合更紧密。【结论】通过定点饱和突变获得了催化性能显著提升的优良突变体D118V,研究结果为甾体11α羟化酶的改造提供了应用案例和理论指导。

点饱和突变技术及其在蛋白质工程中的应用

点饱和突变技术是蛋白质工程中的一门新兴技术,它通过对目的蛋白的编码基因进行改造,短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种氨基酸替代的突变子。此技术不仅是蛋白质定向改造的强有力工具,而且是蛋白质结构-功能关系研究的重要手段。概述了几种常用点饱和突变技术,介绍和讨论了它在蛋白质工程中的应用状况,存在的问题,并展望了其应用前景。

定点饱和突变改善米曲霉木聚糖酶的温度特性

为改善米曲霉木聚糖酶AoXyn11A的温度特性,基于其三维结构的同源建模和分子动力学模拟,随机替换最高B-factor值位点处的Gly21。以重组表达质粒pET-28a-Aoxyn11A为模板,采用全质粒两步PCR技术对AoXyn11A基因(Aoxyn11A)中编码Gly21的密码子实施饱和突变,将pET-28a-Aoxyn11A各突变体转化E.coli BL21(DE3),构建了突变转化子文库。以酶的热稳定性为指标,从文库中筛选出最优突变转化子(E.coli/Aoxyn11AG21I)。DNA测序结果显示,E.coli/Aoxyn11AG21I表达一种由Ile21替换了Gly21的突变酶AoXyn11AG21I。温度特性分析表明:突变酶的最适温度由突变前的55℃提高至65℃;AoXyn11AG21I在55℃及以下稳定,较AoXyn11A提高了7℃。另外,AoXyn11A突变前后的pH特性改变不大。

抗HBV C区G_(11)饱和突变的发夹状核酶的体外制备

研究针对 HBV C区的 G1 1 位饱和突变的发夹状核酶的体外制备 ,通过计算机设计针对 HBV C区的发夹状核酶 ,合成 G1 1 位饱和突变的发夹状核酶基因片段 ,并把其克隆入自剪切核酶载体 p1.5的 3′- cis- Rz或 5′- cis- Rz之间。3 2 P标记 4种发夹状核酶的体外转录物 ,变性聚丙烯酰胺纯化回收获得 4种核酶。

点饱和突变提高腈水解酶不对称合成L-2-氨基丁酸的酶活

为了提高腈水解酶催化外消旋2-氨基丁腈不对称合成L-2-氨基丁酸的能力,首先从实验室的腈水解重组大肠杆菌中筛选获得了一株立体选择性较高的菌株E.coli BL21(DE3)/p ET-28bbll6402。通过对其腈水解酶Nitbll6402进行三维结构同源模建和"热点"氨基酸分析,选择了6个位于"疏水口袋"附近的氨基酸残基(Y198、P239、P272、K251、E240和M234)进行点饱和突变,得到酶活力明显提高的突变型腈水解酶E240G和K251C。在60 mmol/L底物下,生成的L-2-氨基丁酸的e.e值均为100%,浓度分别为5.43 g/L和5.29 g/L,比原始酶分别提高了63%和59%。此结果表明,E240G或K251C的单点突变均能在不影响立体选择性的前提下不同程度的提高腈水解酶Nitbll6402合成L-2-氨基丁酸的能力,这将为利用腈水解酶催化合成L-2-氨基丁酸的进一步研究奠定重要的理论基础。

Pseudom onas sp.101甲酸脱氢酶基因的合成、表达及定点饱和突变

甲酸脱氢酶(FDH)是氧化还原酶辅酶NAD+和NADH再生循环体系中的关键酶,具有重要的应用价值和产业化应用前景。通过采用重叠延伸PCR技术,人工合成编码FDH的基因fdh,构建原核表达载体pET30a-fdh,以E.coliBL21(DE3)为表达宿主,获得了能可溶性表达的甲酸脱氢酶的重组菌;经16℃IPTG诱导表达,重组酶的比活力为8.7 U/mgPro;为了提高FDH的稳定性,采用融合PCR方法对fdh基因进行了定点饱和突变,经筛选,获得了酶活未变但稳定性有所提高的突变酶Cys146AlaCys354Ala,其稳定性比野生酶提高了2.5倍。

甘蔗叶灼病解毒蛋白——AlbD S40位点饱和突变分析

利用overlapping PCR技术对甘蔗叶灼病解毒蛋白-AlbD酶S40关键位点进行饱和突变,共获得19种突变子,并测试不同突变子的脱毒活性和酯酶活性.结果显示,S40A和S40R突变子分别使AlbD酶脱毒活性提高12.8%和9.5%.以对硝基苯丁酸酯为底物,S40Q可使AlbD酶酯酶活性提高20%;以对硝基苯戊酸酯为底物,S40G可使其活性提高30%.

地芽孢杆菌Geobacillus sp.GXS1α-淀粉酶的饱和突变及酶学性质研究

采用半理性设计方法,在网站Geno3D上以PDB数据库中B.stearothermophilus麦芽糖淀粉酶(BSMA)的三维结构为模板,对AMY(α-淀粉酶)进行三维结构同源建模(二者氨基酸的同源性为33%)。比较同源建模预测的3D结构和模板BSMA的3D结构关键位点,在此基础上通过计算机辅助设计软件ProSa2003,根据能量变化确定了AMY三个饱和突变位点:D192、E221和D289。利用兼并引物对AMY的假定活性中心位点D192、E221和D289的氨基酸分别进行饱和突变,定点(饱和)突变库筛选得到4个有活力的突变子D192A、E221N、E221L和D289L,并对突变酶的酶学性质进行初步研究。

饱和突变定向进化细胞色素P450 BM-3

为了进一步获得具有更高活力的细胞色素P450 BM-3(F87V/A74G/L188Q)突变酶,利用饱和突变技术对该突变酶的4个氨基酸位点D168、A225、K434、E435分别进行单一的随机突变,通过对其羟基化吲哚生成靛蓝的催化性能表征,发现P450 BM-3氨基酸残基的168、434和435位均位于蛋白功能区域,而225位则位于非功能区域,同时发现突变酶D168H具有更高的结合辅酶NADPH的能力,其消耗NADPH的能力几乎是亲本酶的8倍,但生成靛蓝的能力却只是亲本酶的3倍,说明该位点极有可能承担了将电子从黄素单核苷酸(FMN)氧化还原酶区域传递到亚铁血红素区域的任务,在P450 BM-3结构与功能的关系中扮演着重要的角色.

斑马鱼反转录病毒插入突变技术的发展及其在基因饱和突变与筛选中的应用

用于大规模基因突变与筛选的主要策略有化学诱变、插入突变、基因诱捕。插入突变是一种通过外源DNA整合的方式来获得突变体 ,并克隆得到对应突变基因的方法。运用反转录病毒介导的插入突变技术 ,在脊椎动物斑马鱼中已经获得了许多影响胚胎发育和细胞生长过程的突变体 ,并找到了对应的基因。基因诱捕技术也被运用于反转录病毒载体的构建。这套系统的建立使斑马鱼成为第一个有可能达到基因饱和突变和筛选的脊椎动物。

饱和突变提高肌酸酶热稳定性

为提高肌酸酶(Creatinase,EC 3.5.3.3,CRE)的热稳定性,通过序列比对的方法确定了Arthrobacter nicotianae 23710 CRE热稳定性相关位点K195,并对其进行饱和突变。与野生酶相比,突变体K195V、K195T、K195C和K195L在50℃下的半衰期分别提高260%、230%、60%和20%;其中,K195V和K195C比酶活分别提高80.7%和88.2%,其他突变体比酶活无明显变化;突变体K195V、K195T、K195C和K195L的催化效率(kcat/Km)分别提高131%、218%、83%和100%。结构分析发现,突变体K195V、K195T、K195L较野生酶分别增加了7、12和13个氢键。结果表明:对Lys195的突变可有效改变CRE的热稳定性及催化效率,且分子内部氢键的增加可能是CRE热稳定性提高的重要原因之一。

采用饱和突变提高谷氨酰胺酶的热稳定性

为提高谷氨酰胺酶(glutaminase,EC 3. 5. 1. 2)的热稳定性,利用Discovery studio 2017对Bacillus subtilis谷氨酰胺酶(YbgJ)中具有不利相互作用的49个氨基酸进行虚拟突变,确定了影响酶热稳定性的关键氨基酸位点E3、E55、D213。对上述3个位点分别进行饱和突变,筛选得到55℃半衰期(t_(1/2))较野生酶分别提高58%、69%和41%的突变体E3C、E55F和D213T。构建复合突变体E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T和E55F/D213T,其t_(1/2)分别较野生酶提高1.73、1.44、1.22和0.97倍。其中,E3C/E55F比酶活较野生酶提高23%,达到693 U/mg。作用力分析发现,突变体E3C/E55F/D213T、E3C/E55F、E3C/D213T和E55F/D213T分别较野生酶增加30、23、11和8个氢键及减少5、4、4和3个不利相互作用。上述结果表明,酶分子内部关键氨基酸的替换对YbgJ热稳定性有较大的影响,且分子内部不利相互作用的减少和氢键的增加可能是YbgJ热稳定性提高的重要原因。

迭代饱和突变提高卤醇脱卤酶HheA_(AM)催化制备6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的酶活

(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯(A7)是合成降血脂药物阿托伐他汀钙的关键手性中间体,利用卤醇脱卤酶催化(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯(D3)的脱卤氰化反应制备A7是很有潜力的合成方法。现有研究存在的主要问题是卤醇脱卤酶种类少,对底物D3的催化活性很低,且鲜见有关脱卤酶分子改造提高其对D3催化活性的报道。本研究利用基因挖掘技术获得了一个对D3表现出较高催化活力的卤醇脱卤酶HheA_(AM) (来源于Agromycesmediolanus sp.),运用定向进化和半理性设计方法确定了4个影响酶活的关键位点(84、88、136、144位),然后使用迭代饱和突变(ISM)策略对这4个位点进行组合突变,突变株M4-HheA_(AM)(84S-88L-136T-144C)的比酶活为0.89U·mg-1,是野生型HheA_(AM)(Wt-HheA_(AM))的13倍,对D3的催化活性得到了显著的提高。

定点饱和突变提高L-脯氨酸-4-羟化酶的酶活

为了提高L-脯氨酸-4-羟化酶(P4H)合成反式-4-羟基-L-脯氨酸(4-Hyp)的能力,首先对实验室前期构建的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET-28b-p4h的P4H进行三维结构模拟和"热点"氨基酸分析,选择了7个位于"疏水口袋"附近的氨基酸残基(Y205,K207I241,F137,T142,V53和R45)进行定点饱和突变,得到P4H酶活力明显提高的突变型酶F137R和Y205K。采用F137R和Y205K催化转化0.35g/L L-脯氨酸产物4(Hyp质量浓度分别为55.09mg/L和52.29mg/L),比野生型酶分别提高了58%和50%。经过分子对接比较发现,突变型P4H的活性中心没有发生显著变化,酶活的提高可能是由于突变作用使蛋白构型发生了轻微改变,增加了该酶与底物或辅底物的亲和力引起的。该结果为进一步利用P4H生物合成4-Hyp提供了重要的理论基础。

饱和突变改善米曲霉11家族木聚糖酶AEx11A的催化特性

为改善米曲霉(Aspergillus oryzae)11家族木聚糖酶AEx11A的催化特性,作者采用全质粒PCR方法对AEx11A基因(AEx11A)中编码Thr98、Asn100、Val124、Pro129和Ile132的密码子实施饱和突变,构建饱和突变文库。以木聚糖酶的酶活性为指标,采用DNS法从文库中筛选出酶活性提高30%以上的转化子。对其中酶活性提高最明显的两个位点Thr98和Val124实施迭代饱和突变,筛选出最优突变子AEx11AT98D-V124Q,其纯化后的比活性及催化效率分别为AEx11A的3.04和2.74倍。此外,突变酶AEx11AV124T的热稳定性较AEx11A有一定的提高,其余2个突变酶的温度特性与AEx11A差异不大。

一种改进的基于PCR的建立饱和突变库的方法

定点饱和诱变技术一直以来被广泛应用于蛋白的定向进化和代谢途径的研究,然而建立偏爱性低的高质量饱和突变库一直面临着严峻挑战.提出一种改进的建立智能突变体文库的方法,选取柠檬烯环氧水解酶(LEH)为突变对象,摒弃传统的NNK/NNN密码子简并引物,采用半理性设计突变氨基酸的方法,将PCR反扩载体与T5介导的克隆方法联用,构建一个随机的四点组合突变体库,突变效率高达81. 25%.此外,突变库的偏爱性大大降低,突变氨基酸的分布趋于平均,表现出低测序倍数基础上的高覆盖率.因此该方法极大提高了突变库的质量,降低了筛选成本,为蛋白质工程和生物合成的研究提供了好的思路.

迭代饱和突变提高Bacillus cereus胺脱氢酶对苯乙酮还原的催化效率

基于同源建模建立了Bacillus cereus胺脱氢酶(Bc AmDH)的三维结构,采用半理性设计方法,对底物结合口袋附近的8个氨基酸残基(L42,G43,M67,A115,E116,T136,V293和V296)分别进行单点饱和突变,通过显色法筛选出3个正向突变位点(116,136和293).进一步采用迭代饱和突变策略对这3个正向位点进行组合突变,获得最优突变株V293A/E116V/T136S,其对苯乙酮还原反应的催化效率达到2.54 L·min-1·mmol-1,比Bc AmDH提高了719%;与Bc AmDH相比,最优突变株在催化苯乙酮的不对称还原反应时,底物浓度由100 mmol/L提高至300 mmol/L,转化率由42.1%提高至80.2%.分子对接结果表明,突变株底物结合口袋的位阻减小和底物进出通道的扩大是提高催化效率的主要原因.

Lys490饱和突变提高海藻糖合酶转化率的研究

分析预测海藻糖合酶的空间结构,并进行分子对接和序列比对,选择Lys490位点进行定点饱和突变。利用全质粒PCR方法构建饱和突变体库,并利用高效液相色谱法筛选优势突变。经过筛选获得优势突变体K490L、K490I,对比分析表明,突变体K490L、K490I的转化率较原始酶分别提高了18%和15%。突变体酶学性质分析表明,K490L、K490I的最适反应温度及最适pH与原始酶保持一致,皆为25℃和pH 8.0,但两种突变酶的耐热性及耐酸性较原始酶有明显增强。在pH 7.0环境下,突变体K490L、K490I放置60 min后,剩余酶活力均达80%以上,而原始酶低于68%。

芳香硫酸酯酶定点饱和突变方案的比较

目的比较随机引物与精确引物PCR扩增实施绿脓杆菌芳香硫酸酯酶(Pseudomonas aeruginosa arylsulfatase, PAAS)定点饱和突变的整体效率及成本,以建立高效实用的定点饱和突变方案。方法以大肠杆菌碱性磷酸酶(Escherichia coli alkaline phosphatase, ECAP)与PAAS融合表达质粒为模板,分别用针对PAAS目的位点的随机引物、精确引物等量混合物及单个精确引物,进行全质粒PCR扩增构建定点饱和突变体库;碱裂解细胞后高通量测定PAAS突变体与ECAP活性比值进行筛选,比较3种定点饱和突变建库方案需筛选的单克隆数量、所获突变体种类、整体耗时、整体成本及影响因素。结果用随机引物PCR对M72位定点饱和突变有明显密码子偏好性,筛选超600个单克隆仅获得10种预期突变体,但对G138位定点饱和突变未见明显的密码子偏好性且筛选不到150个单克隆获得18种预期突变体;精确引物等量混合物对M72位实施定点饱和突变,筛选不超过190个克隆成功获得19种预期突变体;单个精确引物对M72位逐个PCR实施定点饱和突变,仅各筛选2个单克隆就获得19种预期突变体。单个精确引物逐个PCR实施定点突变所获饱和突变体库完整,需筛选的单克隆数最少,总耗时和总成本最低;相比之下,用随机引物和精确引物等量混合物实施定点饱和突变时,所需筛选的单克隆数、整体耗时及成本均显著增加。结论解析序列-活性关系时,用单个精确引物逐个PCR实施定点饱和突变有显著整体成本和效率优势;仅筛选阳性突变体时,用精确引物等量混合物进行PCR建库在成本和效率上更有优势。

生孢噬纤维菌纤维素酶关键氨基酸饱和突变及性质

Sm_2974是来源于生孢噬纤维菌(Sporocytophaga myxococcoides)的一个双功能纤维素酶,具有较高的催化效率。以Sm_2974为模板,将第205位色氨酸残基进行饱和突变后,所有突变体的CMC酶活和pNPC酶活均有不同程度的降低,而色氨酸向酪氨酸的突变使Sm_2974的pNPC酶活完全丧失。突变为天冬氨酸使Sm_2974对滤纸纤维素的水解能力增加,而突变为苏氨酸和谷氨酰胺则使Sm_2974与滤纸底物的结合能力降低,进而影响了酶催化效率。结果表明,第205位色氨酸残基对Sm_2974的底物结合能力及纤维素水解能力均有重要影响,可能是酶活性中心的关键氨基酸残基。