香叶基香叶基焦磷酸合成酶在肺鳞状细胞癌中的表达及临床意义

目的·利用生物信息学和免疫组织化学法探究在肺鳞状细胞癌(lung squamous cell carcinoma,LUSC)组织中香叶基香叶基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase 1,GGPS1)的表达及其临床意义。方法·首先从UCSC Xena平台下载LUSC组织与配对正常组织的转录组数据,使用R语言进行数据标准化和差异表达分析,并利用UALCAN数据库进行验证;采用UALCAN和LinkedOmics数据库分析LUSC患者中GGPS1表达与临床病理特征关系;利用Kaplan-Meier Plotter数据库探究LUSC患者GGPS1表达对预后的影响。应用最小绝对收缩和选择算子(least absolute shrinkage and selection operator,LASSO)回归分析筛选基因相关系数及风险评分。通过列线图和校正曲线评价GGPS1对LUSC的诊断价值。采用STRING、GeneMANIA数据库构建GGPS1蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络。运用R语言挑选与GGPS1相关差异基因,并进行基因本体论(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析。采用免疫组织化学法检测LUSC患者GGPS1表达情况,并分析其与临床病理特征和预后的相关性。结果·通过TIMER2.0数据库检索到GGPS1在多数肿瘤中表达均升高,且在LUSC中呈高表达。UCSC Xena、UALCAN数据库中GGPS1在LUSC的表达高于癌旁组织(均P<0.05)。UALCAN和LinkedOmics数据库发现GGPS1在指标分期较晚患者中的表达水平更高,且Kaplan-Meier Plotter数据库显示LUSC患者GGPS1高表达总生存期(overall survival,OS)较短(P<0.05)。基于LASSO回归评估LUSC患者有较好的风险预测效能。构建LUSC患者的个体化预测模型具有最佳预测准确度。GO、KEGG结果显示,GGPS1相关基因主要与蛋白质代谢、调节脂质和胆固醇代谢过程、尼古丁成瘾、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)、过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferatoractivated receptors,PPAR)信号通路等有关。GGPS1的代谢功能可能促进肿瘤发生。免疫组化结果提示GGPS1主要定位于细胞质中,且LUSC组织中表达高于癌旁组织(P<0.05),GGPS1高表达与LUSC患者肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期有关(均P<0.05),且GGPS1表达高的患者OS明显短于低表达者(P=0.000)。多因素Cox回归分析提示GGPS1可作为LUSC的独立预后因素。结论·相较于正常肺组织,GGPS1在LUSC中表达显著升高,尤其在肿瘤体积较大、淋巴结转移阳性及晚期的患者中表达升高更明显;且GGPS1过表达是LUSC患者预后差的独立预测因子。GGPS1有望成为新的LUSC诊治和预防的分子靶点。

红豆杉香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因克隆分析

20碳单位的香叶基香叶基焦磷酸是紫杉醇生物合成的直接前体,它由香叶基香叶基焦磷酸合成酶催化生成。采用RT-PCR技术从高原植物西藏红豆杉中克隆了编码香叶基香叶基焦磷酸合成酶基因,命名为TwGGPPS(Gen- Bank登录号:DQ 364604)。该基因编码区长为1 182 bp,编码393个氨基酸的多肽;生物信息学分析表明TwGGPPS定位于质体,在其氨基端具有长为18个氨基酸的质体转运肽;TwGGPPS属于异戊烯基转运酶家族,具有该酶家族特有的2个天冬氨酸富集基序;分子系统进化分析表明植物的GGPPS分为被子植物和裸子植物2种类型,TwGGPPS属于裸子植物类型的GGPPS;对TwGGPPS的蛋白质结构模拟分析结果表明,TwGGPPS由大量的α-螺旋通过随机卷曲连接而成,这些α-螺旋环绕形成一个袋状空腔,其空腔口部为底物结合与碳链延伸的活性部位。对TwGGPPS基因组结构的分析表明该基因没有内含子。该基因的克隆和分析为实现紫杉醇的基因工程提供了一个重要的基因和作用靶点。

急性呼吸窘迫综合征患者香叶基香叶基焦磷酸合成酶的表达及其临床意义

目的·通过检测急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)患者外周血单个核细胞中香叶基香叶基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPS)的表达情况,研究GGPPS在ARDS诊治中的临床意义。方法·通过定量反转录聚合酶链反应检测ARDS患者(ARDS组)和正常人群(对照组)外周血单个核细胞中GGPPS mRNA水平,采用蛋白质印迹法(Western blotting)检测ARDS组和对照组外周血单个核细胞中GGPPS蛋白表达水平。同时比较ARDS存活组和死亡组GGPPS的表达差异,并采用Spearman相关分析明确GGPPS表达与ARDS患者临床指标的相关性。结果·ARDS组外周血单个核细胞中GGPPS mRNA水平明显高于对照组(P=0.000),并且随ARDS病情加重逐渐升高(P<0.05)。ARDS组外周血单个核细胞中GGPPS蛋白表达明显高于对照组(P<0.05),并且随病情加重逐渐升高(P<0.05)。ARDS死亡组外周血单个核细胞中GGPPS mRNA水平及蛋白表达水平高于ARDS存活组(P<0.05)。ARDS患者外周血单个核细胞中GGPPS mRNA高表达与高的急性生理与慢性健康评分Ⅱ(APACHE Ⅱ)(r=0.862,P=0.000)、高序贯器官功能衰竭估计(SOFA)评分(r=0.719,P=0.023)、低氧合指数(r=-0.821,P=0.000)、高C反应蛋白(r=0.758,P=0.024)及高白细胞计数(r=0.761,P=0.015)相关。结论·ARDS患者外周血单个核细胞中GGPPS表达水平升高,且其表达水平与ARDS病情严重程度及预后相关,GGPPS有望成为ARDS病情严重程度评估的生物标志物。

基于关键节点代谢流重排提高酿酒酵母的香叶基香叶醇产量

香叶基香叶醇(geranylgeraniol,GGOH)是生产香料、药物、维生素A和E的重要中间体,其生物活性构型为(E,E,E)-GGOH。为了提高酿酒酵母的(E,E,E)-GGOH产量,在表达了香叶基香叶基焦磷酸合酶-法尼基焦磷酸合酶融合酶(BTS1-DPP1)和香叶基香叶基焦磷酸合酶-二酰基甘油二磷酸磷酸酶融合酶(BTS1-ERG20)的初始菌株(产34.85mg?L^(-1)GGOH)的基础上,本实验进一步利用代谢工程的手段对法尼基焦磷酸(FPP)代谢节点处进行代谢流重排。一方面,过表达了来源于红法夫酵母的香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)合酶突变体(Crt E03M),增加了前体物质GGPP的供应,从而将GGOH产量提高了1.6倍,达到56.04mg?L^(-1);另一方面,利用葡萄糖诱导性弱启动子PHXT1对竞争支路关键酶角鲨烯合酶(ERG9)进行下调,从而使GGOH产量提高4.5倍,达到156mg?L^(-1)。同时,通过敲除GAL80基因构建了葡萄糖调控的GAL体系,用以控制GGOH的合成,与PHXT1控制的角鲨烯合成支路一起,构成了顺序表达体系,最终,以十二烷为有机相,在摇瓶中进行两相发酵,培养72 h后获得GGOH产量183.07mg?L^(-1),与初始菌株相比提高了5倍。本工作对其他FPP下游途径的代谢调控具有借鉴意义。

蓝桉叶片桉叶素生物合成机理研究

为探明蓝桉(Eucalyptus globulus Labill.)叶片桉叶素合成过程中关键酶活性与桉叶素含量的关系,以不同发育阶段的蓝桉叶片为研究对象,测定桉叶素相对含量和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、异戊烯基焦磷酸异构酶(IPPI)、香叶基焦磷酸合酶(GPPS)、桉叶素合酶(CinS)活性,并对其进行方差分析、相关性分析、通径分析.结果表明,随着蓝桉叶片成熟度增加,桉叶素相对含量逐渐增加,HMGR、DXS、GPPS、IPPI的酶活性逐渐下降.在一个完整的年生长周期内,桉叶素相对含量在7月份显著高于其余月份,HMGR、DXS、GPPS、CinS活性在5、6月份显著高于其余月份.桉叶素相对含量与DXS、CinS活性显著正相关,与HMGR、IPPI、GPPS酶活性极显著负相关.研究结果表明,在5、6月份增强蓝桉幼嫩叶片的DXS和CinS活性,可以有效提高桉叶素积累,进而提高蓝桉桉叶油的产量和品质.

香紫苏醇的微生物法生产研究进展

香紫苏醇是一种植物次生代谢物,可从天然香紫苏醇等植物中提取,主要用于香紫苏内酯及降龙涎醚等天然龙涎香代用品的合成及香精的调配,还具有抗菌、杀菌活性等。由于生物技术的发展,利用微生物法合成香紫苏醇已引起国内外学者的广泛关注。本文概述了香紫苏醇及其衍生物的经济价值,并详细概述了微生物生产香紫苏醇的流程及研究状况。最后,本文还展望了微物生产法在香紫苏醇生产工业中应用前景及研究方向。尽管对微生物生产香紫苏醇的相关研究已取得了比较大的进步,但香紫苏醇合成的产率仍相对较低,因此,将分子生物学及代谢工程学手段融入到香紫苏醇合成及产业化应用的探索将是以后的研究重点。

血浆GGPPS水平预测急性呼吸窘迫综合征严重程度及预后的研究

目的研究血浆香叶基香叶基焦磷酸合成酶(Geranyl geranyl diphosphate synthase,GGPPS)表达水平与急性呼吸窘迫综合征(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)患者严重程度的关系及其预后的判断价值。方法通过酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测ARDS患者(ARDS组)和健康人群(对照组)血浆GGPPS水平,比较两组血浆GGPPS表达情况,比较轻度、中度、重度ARDS患者GGPPS表达水平,并对ARDS患者死亡组与存活组血浆GGPPS表达水平进行比较,同时分析ARDS患者血浆GGPPS表达与其他临床指标的关系,并绘制受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,ROC),判断血浆GGPPS表达水平对ARDS患者预后价值。结果ARDS组血浆GGPPS水平表达明显高于对照组,并随着病情加重表达水平增高。ARDS死亡组血浆GGPPS水平高于ARDS存活组。ARDS患者中血浆GGPPS水平高表达,与高APACHEⅡ评分(r=0.429,P=0.000)、高SOFA评分(r=0.305,P=0.006)、低氧合指数(r=-0.836,P=0.000)、高白细胞计数(r=0.340,P=0.002)、高C反应蛋白(r=0.325,P=0.003)及高Lac(r=0.438,P=0.000)相关。血浆GGPPS水平预测ARDS患者预后的AUC是0.764,对ARDS患者预后有预测价值,最佳预测阈值为134.92 ng/L。结论ARDS患者血浆GGPPS表达水平高于正常人群,且其表达水平与ARDS病情严重程度及预后相关,GGPPS有望成为评估ARDS病情严重程度及预后的生物标志物。

丹参SmGGPPS3基因的克隆及表达分析

香叶基香叶基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)是植物细胞二萜类物质合成的重要调节靶点。本研究从药用植物丹参中克隆了一条新的GGPPS基因(SmGGPPS3),基因全长2908 bp,包含一个931 bp的内含子和一个960 bp的编码序列。推测的氨基酸序列与蓖麻、橡胶、拟南芥等植物GGPPS一致性达到67%以上。实时定量PCR结果显示,SmGGPPS3基因在丹参不同发育时期不同器官中表达差异显著,同时受茉莉酸甲酯和病原菌的诱导。遗传互补实验也表明,SmGGPPS3编码蛋白具有GGPP合酶的活性。

洛伐他汀对系膜细胞增生及细胞外基质分泌的影响

目的 :观察洛伐他汀对系膜细胞增生及细胞外基质分泌的影响 ,并探讨其作用的可能机制。 方法 :用MTT法检测细胞增生 ,流式细胞仪检测细胞周期 ,ELISA检测细胞外基质胶原Ⅳ和层粘连蛋白。 结果 :洛代他汀可剂量依赖性地抑制系膜细胞增生 ,影响细胞周期 ,使G0 G1期细胞增多 ,S期细胞减少 ,并能明显抑制胶原Ⅳ和层粘连蛋白分泌 (P <0 0 1)。而香叶基香叶基焦磷酸可阻止洛伐他汀对系膜细胞增生的抑制作用。 结论 :洛伐他汀可显著抑制系膜细胞增生及细胞外基质分泌 ,其机制可能与抑制香叶基香叶基焦磷酸产生而阻止信号传导有关。

酿酒酵母单萜合成的研究进展

萜类化合物是以异戊二烯为基本单元的一大类天然化合物,广泛存在于植物、微生物及昆虫中。其中,单萜类化合物主要用于高级香料及化妆品、食品添加剂、杀虫剂、除草剂和新型燃料等的生产,具有广泛的应用潜力。近年来,研究人员已构建出多种萜类化合物的酿酒酵母工程菌株,且通过代谢工程和合成生物学的方法有效提高了产品的产量。但是单萜的微生物合成却相对落后,其中前体供给不足及单萜对微生物毒性强等因素限制了其高效合成。主要从以下几个方面阐述了利用酿酒酵母合成单萜类化合物的目前研究进展:包括单萜合成酶在酿酒酵母中的表达,利用动态调控、蛋白质工程等策略增强酿酒酵母中前体香叶基焦磷酸的合成通量,减少单萜的内源性转化,提高酿酒酵母菌株对单萜的耐受性。在此基础上,结合本课题组的前期工作,针对微生物合成单萜过程中依然存在的瓶颈问题提出可能的解决策略,旨在为进一步优化酿酒酵母单萜合成细胞工厂提供参考。

GGPPS及其抑制剂在肿瘤中的研究进展

香叶基香叶基焦磷酸合酶(geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPS)是甲羟戊酸途径中的一种分支酶,参与蛋白质异戊二烯化。GGPPS通过介导多条细胞信号通路,在细胞的生物学功能和疾病的发生机制中发挥关键作用,调节各种疾病的病理进展。GGPPS在肿瘤中表达异常,而表达水平与预后密切相关,故有望成为肿瘤早期诊治的一种新兴的生物指标。本文主要对GGPPS的生物学功能、在肿瘤中的作用及其抑制剂在肿瘤中的应用进行总结,寻求其在未来肿瘤疾病防治中的潜在价值。

洛伐他丁对肝星状细胞增殖及细胞外基质分泌的影响

目的 观察洛伐他丁对肝星状细胞增殖及细胞外基质分泌的影响,并探讨其作用机制。方法 用不同浓度的洛伐他丁和胆固醇合成过程中产生的非脂性中间产物香叶基香叶基焦磷酸处理大鼠肝星状细胞株;用MTT法检测细胞增殖,流式细胞仪检测细胞周期,ELISA检测细胞外基质IV型胶原和层粘连蛋白,免疫细胞化学结合计算机图文分析系统检测c—jun、c-fos基因表达。结果 洛伐他丁可剂量依赖性地抑制肝星状细胞增殖（对照组A值24 h和48 h分别为0.736±0.090和0.972±0.097,洛伐他丁浓度在10μmol/L时24h和48h分别为0.602±0.049和0.785±0.028,两组比较差异有显著性）,影响其细胞周期,使G0/G1期细胞增多,S期细胞减少,并明显抑制c-jun、c—fos表达（洛伐他丁浓度在 50μmol/L时分别较对照组降低51.5％和 54.5％）,抑制IV型胶原和层粘连蛋白分泌（P<0.01）。而香叶基香叶基焦磷酸可部分拮抗洛伐他丁的上述抑制作用。结论 洛伐他丁可显著抑制肝星状细胞增殖及细胞外基质分泌,其机制可能与抑制香叶基香叶基焦磷酸产生而阻止信号转导有关。

芍药GGPPS家族基因的克隆及生物信息学分析

萜类物质是芍药根的重要药用活性成分,香叶基香叶基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)是萜类物质生物合成的关键酶。为研究GGPPS基因在芍药根萜类物质生物合成中的作用,本研究基于芍药转录组测序数据(DRX027794),从芍药根中成功克隆了PlGGPPS家族的3个基因并对其进行了生物信息学分析。结果表明,PlGGPPS、PlGGPPSssu-like和PlGGPPSssu基因(GenBank登录号分别为KP708574,KP708573和KP708572)分别编码含有369、298和340个氨基酸的蛋白质,它们与多种近缘植物GGPPS蛋白家族成员具高同源性。预测的蛋白质均隶属于萜类合酶超级家族,然而PlGGPPSssu-like蛋白缺少保守的FARM和SARM保守结构域,分子进化树分析结构显示其分类地位相对独立。蛋白亚细胞定位于叶绿体或质体,为不含跨膜结构域、不含信号肽的不稳定蛋白;其二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,三级结构以单体形式存在,为后续开展PlGGPPS家族中PlGGPPS、PlGGPPSssu-like和PlGGPPSssu基因的时空表达特性分析及其功能研究提供了理论基础。

刺五加GPS基因克隆及表达特征与皂苷含量相关性研究

目的克隆刺五加香叶基焦磷酸合成酶(geranyl pyrophosphate synthase,GPS)基因的cDNA序列并分析基因序列特征、不同器官中基因表达水平及其与皂苷含量的相关性。方法提取刺五加的RNA,逆转录为cDNA。根据转录组测序结果中编码GPS的unigene(c37362.graph_c0),设计特异性引物,经过PCR扩增GPS基因的cDNA全长。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析GPS基因在不同器官中的表达水平,并通过分光光度法检测刺五加总皂苷含量。结果克隆得到长1260bp、编码419个氨基酸的刺五加GPS基因cDNA。GPS蛋白定位于线粒体内且不存在跨膜区域。GPS基因在各个器官中均有表达,在叶片中的表达量最高,是根中表达量的5.26倍。GPS基因的相对表达量与皂苷量呈现出同升同降的变化趋势,表现为显著正相关关系(r=0.851,P<0.05)。结论首次克隆获得刺五加GPS基因的cDNA全长序列,明确了刺五加GPS基因的表达量与皂苷含量之间存在正相关关系。

栀子(Gardenia jasminoides)GGPPS基因小亚基的克隆及表达分析

香叶基焦磷酸(geranyl pyrophosphate,GPP)是单萜的前体物质,而单萜是栀子内重要的活性成分。香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)在萜类化合物、类胡萝卜素类化合物生物合成中处于关键位置,GGPPS主要分为香叶基香叶基焦磷酸合成酶大亚基(GGPPSlsu)和香叶基香叶基焦磷酸合成酶小亚基(GGPPSssu)。为了研究栀子GGPPS基因在栀子萜类生物合成中的作用,本研究成功从栀子品种‘林海一号’中提取RNA反转录合成cDNA,根据转录组测序拼接结果设计引物扩增得到栀子GGPPSssu的cDNA序列,分别命名为GjGGPPSssu1和GjGGPPSssu2,ORF区分别为1053 bp和915 bp。通过构建基因进化树,栀子GGPPSssu基因和其他植物的GGPPSssu基因聚为一类,属于香叶基香叶基焦磷酸合成酶小亚基基因。通过蛋白质序列比对表明GjGGPPSssu1有一个CxxxC(x为碱性氨基酸)的保守基元和一个FARM的保守基元,没有SARM保守基元,与SSUⅡ类基因相似;GjGGPPSssu2有两个CxxxC的保守基元,没有FARM保守基元和SARM保守基元,与SSUⅠ类基因相似。荧光定量PCR试验结果表明,GjGGPPSssu1在T4和T5时期有较高的表达水平,GjGGPPSssu2在栀子各生长时期的根部和果实中有较高水平的表达。推测GjGGPPSssu1基因与栀子黄色素合成相关,GjGGPPSssu2基因与单萜合成相关。本研究初步解析了栀子GGPPS基因的功能,为提高栀子药用品质提供了理论依据。