基于关键节点代谢流重排提高酿酒酵母的香叶基香叶醇产量

香叶基香叶醇(geranylgeraniol,GGOH)是生产香料、药物、维生素A和E的重要中间体,其生物活性构型为(E,E,E)-GGOH。为了提高酿酒酵母的(E,E,E)-GGOH产量,在表达了香叶基香叶基焦磷酸合酶-法尼基焦磷酸合酶融合酶(BTS1-DPP1)和香叶基香叶基焦磷酸合酶-二酰基甘油二磷酸磷酸酶融合酶(BTS1-ERG20)的初始菌株(产34.85mg?L^(-1)GGOH)的基础上,本实验进一步利用代谢工程的手段对法尼基焦磷酸(FPP)代谢节点处进行代谢流重排。一方面,过表达了来源于红法夫酵母的香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)合酶突变体(Crt E03M),增加了前体物质GGPP的供应,从而将GGOH产量提高了1.6倍,达到56.04mg?L^(-1);另一方面,利用葡萄糖诱导性弱启动子PHXT1对竞争支路关键酶角鲨烯合酶(ERG9)进行下调,从而使GGOH产量提高4.5倍,达到156mg?L^(-1)。同时,通过敲除GAL80基因构建了葡萄糖调控的GAL体系,用以控制GGOH的合成,与PHXT1控制的角鲨烯合成支路一起,构成了顺序表达体系,最终,以十二烷为有机相,在摇瓶中进行两相发酵,培养72 h后获得GGOH产量183.07mg?L^(-1),与初始菌株相比提高了5倍。本工作对其他FPP下游途径的代谢调控具有借鉴意义。

蓝桉叶片桉叶素生物合成机理研究

为探明蓝桉(Eucalyptus globulus Labill.)叶片桉叶素合成过程中关键酶活性与桉叶素含量的关系,以不同发育阶段的蓝桉叶片为研究对象,测定桉叶素相对含量和3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)、1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)、异戊烯基焦磷酸异构酶(IPPI)、香叶基焦磷酸合酶(GPPS)、桉叶素合酶(CinS)活性,并对其进行方差分析、相关性分析、通径分析.结果表明,随着蓝桉叶片成熟度增加,桉叶素相对含量逐渐增加,HMGR、DXS、GPPS、IPPI的酶活性逐渐下降.在一个完整的年生长周期内,桉叶素相对含量在7月份显著高于其余月份,HMGR、DXS、GPPS、CinS活性在5、6月份显著高于其余月份.桉叶素相对含量与DXS、CinS活性显著正相关,与HMGR、IPPI、GPPS酶活性极显著负相关.研究结果表明,在5、6月份增强蓝桉幼嫩叶片的DXS和CinS活性,可以有效提高桉叶素积累,进而提高蓝桉桉叶油的产量和品质.

丹参SmGGPPS3基因的克隆及表达分析

香叶基香叶基焦磷酸合酶(Geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)是植物细胞二萜类物质合成的重要调节靶点。本研究从药用植物丹参中克隆了一条新的GGPPS基因(SmGGPPS3),基因全长2908 bp,包含一个931 bp的内含子和一个960 bp的编码序列。推测的氨基酸序列与蓖麻、橡胶、拟南芥等植物GGPPS一致性达到67%以上。实时定量PCR结果显示,SmGGPPS3基因在丹参不同发育时期不同器官中表达差异显著,同时受茉莉酸甲酯和病原菌的诱导。遗传互补实验也表明,SmGGPPS3编码蛋白具有GGPP合酶的活性。

栀子(Gardenia jasminoides)GGPPS基因小亚基的克隆及表达分析

香叶基焦磷酸(geranyl pyrophosphate,GPP)是单萜的前体物质,而单萜是栀子内重要的活性成分。香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)在萜类化合物、类胡萝卜素类化合物生物合成中处于关键位置,GGPPS主要分为香叶基香叶基焦磷酸合成酶大亚基(GGPPSlsu)和香叶基香叶基焦磷酸合成酶小亚基(GGPPSssu)。为了研究栀子GGPPS基因在栀子萜类生物合成中的作用,本研究成功从栀子品种‘林海一号’中提取RNA反转录合成cDNA,根据转录组测序拼接结果设计引物扩增得到栀子GGPPSssu的cDNA序列,分别命名为GjGGPPSssu1和GjGGPPSssu2,ORF区分别为1053 bp和915 bp。通过构建基因进化树,栀子GGPPSssu基因和其他植物的GGPPSssu基因聚为一类,属于香叶基香叶基焦磷酸合成酶小亚基基因。通过蛋白质序列比对表明GjGGPPSssu1有一个CxxxC(x为碱性氨基酸)的保守基元和一个FARM的保守基元,没有SARM保守基元,与SSUⅡ类基因相似;GjGGPPSssu2有两个CxxxC的保守基元,没有FARM保守基元和SARM保守基元,与SSUⅠ类基因相似。荧光定量PCR试验结果表明,GjGGPPSssu1在T4和T5时期有较高的表达水平,GjGGPPSssu2在栀子各生长时期的根部和果实中有较高水平的表达。推测GjGGPPSssu1基因与栀子黄色素合成相关,GjGGPPSssu2基因与单萜合成相关。本研究初步解析了栀子GGPPS基因的功能,为提高栀子药用品质提供了理论依据。

芍药GGPPS家族基因的克隆及生物信息学分析

萜类物质是芍药根的重要药用活性成分,香叶基香叶基焦磷酸合酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase,GGPPS)是萜类物质生物合成的关键酶。为研究GGPPS基因在芍药根萜类物质生物合成中的作用,本研究基于芍药转录组测序数据(DRX027794),从芍药根中成功克隆了PlGGPPS家族的3个基因并对其进行了生物信息学分析。结果表明,PlGGPPS、PlGGPPSssu-like和PlGGPPSssu基因(GenBank登录号分别为KP708574,KP708573和KP708572)分别编码含有369、298和340个氨基酸的蛋白质,它们与多种近缘植物GGPPS蛋白家族成员具高同源性。预测的蛋白质均隶属于萜类合酶超级家族,然而PlGGPPSssu-like蛋白缺少保守的FARM和SARM保守结构域,分子进化树分析结构显示其分类地位相对独立。蛋白亚细胞定位于叶绿体或质体,为不含跨膜结构域、不含信号肽的不稳定蛋白;其二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,三级结构以单体形式存在,为后续开展PlGGPPS家族中PlGGPPS、PlGGPPSssu-like和PlGGPPSssu基因的时空表达特性分析及其功能研究提供了理论基础。

GGPPS及其抑制剂在肿瘤中的研究进展

香叶基香叶基焦磷酸合酶(geranylgeranyl diphosphate synthase,GGPPS)是甲羟戊酸途径中的一种分支酶,参与蛋白质异戊二烯化。GGPPS通过介导多条细胞信号通路,在细胞的生物学功能和疾病的发生机制中发挥关键作用,调节各种疾病的病理进展。GGPPS在肿瘤中表达异常,而表达水平与预后密切相关,故有望成为肿瘤早期诊治的一种新兴的生物指标。本文主要对GGPPS的生物学功能、在肿瘤中的作用及其抑制剂在肿瘤中的应用进行总结,寻求其在未来肿瘤疾病防治中的潜在价值。