草鱼肠道中香港海鸥型菌的选择性分离与鉴定

从广东省某市池塘采集商品规格(体重2 0～2 5kg)的草鱼(Ctenoharyngodonidellus),利用加有头孢哌酮的麦康凯琼脂培养基,对其肠道中细菌进行选择性分离与鉴定。结果显示,12尾草鱼的肠道中,5尾可分离到具有以下特征的细菌:两端生鞭毛,菌体弯曲似海鸥状,革兰氏染色阴性,过氧化氢酶、氧化酶、尿酶和精氨酸双水解酶阳性,还原硝酸盐,不发酵、氧化或同化葡萄糖、甘露醇等15种常见的糖醇类,细菌形态、生化特性与报道的香港海鸥型菌相似,阳性率为41 7%。但在肌肉中未分离到此菌。进行分离细菌的16SrRNA基因序列分析,与GenBank中登录的4株香港海鸥型菌序列的同源性为99 7%～99 9%。由菌的培养特征、形态特点、理化特性、16SrRNA基因序列分析等多元鉴定的结果表明,从草鱼肠道中选择分离的细菌为香港海鸥型菌。药敏实验结果表明,所分离菌株对奥格门丁和亚胺培南的敏感性与报道的香港海鸥型菌有一定区别。

淡水养殖鱼类中香港海鸥型菌Laribacter hongkongensis的分离和鉴定

首次从广东省淡水养殖鱼类肠道中分离到了引致人类严重腹泻的新现病原菌-香港海鸥型菌,描述了该菌的培养特性、菌落特征和菌体形态,并进行了理化鉴定;初步研究了该菌对抗生素的抗性谱。

广东省水产品中香港海鸥型菌的污染调查与耐药性检测

目的初步了解广东省水产品中香港海鸥型菌(Laribacter hongkongensis)污染及分离株的耐药情况。方法采用改良头孢哌酮麦康凯琼脂(CMA)作为分离培养基,以API 20NE鉴定系统鉴定结果作为确认依据;采用K-B法进行药物敏感试验。结果222份水产样本检出15株目标菌,阳性率6.76%。其中14株分离自草鱼肠脏,1株来自鲤鱼肠脏。分离株及香港海鸥型菌模式株HKU1的药敏结果,对β-内酰胺类抗生素如氨苄西林、头孢噻酚、头孢他啶、头孢曲松等均出现耐药株,未见耐庆大霉素和阿米卡星株。结论结果表明香港海鸥型菌在广东省的草鱼污染率最高,为17.3%(14/81),分离株对β-内酰胺类抗生素耐药情况较严重。

耐复方新诺明香港海鸥型菌中Ⅰ类整合子、磺胺类耐药基因(sul1、sul2)的检测

目的了解香港海鸥型菌淡水鱼与蛙来源分离株磺胺类耐药性以及Ⅰ类整合子介导耐药的情况。方法采用K-B纸片扩散法检测香港海鸥菌耐复方新诺明药物菌株,PCR方法扩增耐药菌株sul1、sul2和Ⅰ类整合子基因。结果 128株香港海鸥菌中共有20株耐复方新诺明药物,耐药率15.6%;20株耐药菌株中sul1阳性率90%,sul2阳性率50%,Ⅰ类整合子携带率80%。结论淡水鱼与蛙来源香港海鸥型菌菌耐磺胺的机制可能与Ⅰ类整合子、sul1、sul2基因有关。

浙江省369份淡、海水鱼香港海鸥型菌污染状况研究

目的掌握浙江省淡、海水鱼中香港海鸥型菌污染状况,为防止食源性香港海鸥型菌病的发生和流行提供科学依据。方法用改良头孢哌酮麦康凯琼脂分离,API20NE鉴定香港海鸥型菌。K-B纸片扩散法作耐药性测定。通用引物扩增16SrDNA并与香港海鸥型菌HKU1株开展同源性比较。结果369份样品检出香港海鸥型菌18株,阳性率为4.88%,其中,鲤鱼检出率为25.00%,草鱼的阳性率为10.26%,海水鱼以及鲫鱼、鲢鱼、扁鱼等淡水鱼中未分离出。分离的香港海鸥型菌16SrDNA序列与HKU1株仅相差1～2个碱基,同源性在99.6%～100.0%之间;18株菌对头孢拉定、万古霉素、甲硝唑、克林霉素、头孢哌酮完全耐药,对红霉素、亚胺培南、克拉霉素、氨曲南、庆大霉素、丁胺卡那霉素、三甲氧苄氨嘧啶、四环素、氯霉素、多粘菌素B、环丙沙星完全敏感,对头孢噻吩、胺苄西林、头孢曲松的耐药性分别为83.33%、61.11%和5.56%。结论浙江省存在香港海鸥型菌污染源,建议相关监督部门应加大这类产品的管理力度,防止香港海鸥型菌病在我省的发生和传播。

香港海鸥型菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR检测技术研究

目的利用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法,建立一种简便、快速、特异、灵敏的香港海鸥型菌检测方法。方法根据香港海鸥型菌16SrDNA的保守区域设计特异性引物和探针。用不同浓度、不同温度对反应体系引物浓度、探针浓度及退火温度进行优化。用添加已知量的香港海鸥型菌样本验证方法敏感性;用香港海鸥型菌以及大肠杆菌、沙门菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌等致病菌验证方法特异性和稳定性。结果当25μL反应体系中上、下游引物(10μmol/L)各为0.6μL,探针(10μmol/L)为0.4μL,模板DNA量为5.0μL,反应条件:预变性95℃20s,变性95℃10s,退火57℃40s,40个循环时,香港海鸥型菌TaqMan-MGB探针实时荧光PCR反应Ct值与待检菌浓度对数具有良好线性关系[Ct=-3.538×log(菌浓度)+13.56,r=0.999],方法的最低检测浓度达到36cfu/mL。23株香港海鸥型菌检测Ct值均小于35,而104株非香港海鸥型菌检测Ct值大于35或扩增曲线成一平滑直线。隔天连续5d重复试验Ct值变异系数小于3。20件活鲤鱼、18件活草鱼香港海鸥型菌检测率实时荧光PCR检测技术显著高于常规检测方法(P<0.01,χ2=21.50)。且后者所需时间为5d,前者仅需10h。结论 TaqMan实时荧光定量PCR法是一种快速简便、特异性强、灵敏度高的香港海鸥型菌检测方法,值得推广应用。

香港海鸥型菌四环素耐药性及其耐药分子机制研究

目的:了解香港海鸥型菌分离株对四环素的耐药性及四环素耐药基因的分布情况。方法:采集草鱼和青蛙的肠道标本,用选择性培养基分离、生化鉴定和16SrRNA基因鉴定的方法分离出香港海鸥型菌。用纸片扩散法对香港海鸥型菌分离株进行四环素类抗生素的耐药性测定,用PCR方法检测四环素耐药株中5种四环素耐药基因的携带情况,并将检测阳性的PCR产物进行序列测定。结果:从614份肠道标本中共分离出157株香港海鸥型菌,其中鱼分离株82株,蛙分离株75株,鱼和蛙的分离率分别为18.51%和43.86%。5株四环素耐药株均来自蛙分离株,其中有2株检测出四环素耐药基因tetA及其阻遏基因tetR,其他四环素耐药基因则未检出。tetA基因的氨基酸序列与已报道的香港海鸥型菌的TetA蛋白同源性为100%。结论:不同宿主的香港海鸥型菌对四环素的耐药性存在显著差异。该菌携带的四环素耐药基因以tetA为主,某些耐药菌株的耐药机制仍然未知。

香港海鸥型菌对喹诺酮耐药性的检测分析

目的:研究香港海鸥型菌对喹诺酮药物的耐药性情况,并评估琼脂稀释法和纸片扩散法对药敏结果的影响。方法:采用琼脂稀释法和纸片扩散法,对不同来源香港海鸥型菌分离株进行4种喹诺酮类抗生素药敏实验,并对两种检测方法所得结果进行比较。结果:136株香港海鸥型菌对4种常见喹诺酮类抗生素敏感率依次为左氧氟沙星>环丙沙星>诺氟沙星>萘啶酮酸。鱼分离株对左氧氟沙星均敏感,对诺氟沙星和环丙沙星的敏感率达到90%以上。蛙分离株对左氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星和萘啶酮酸的敏感率分别为62.50%、37.50%、48.21%、19.64%。采用两种方法检测鱼分离株对左氧氟沙星和环丙沙星两种药物的药敏试验结果具有较好的一致性(>95%),对诺氟沙星具有完全一致性(100%)。对于蛙分离株,两种方法的一致性则较差。结论:香港海鸥型菌对喹诺酮类抗生素的耐药率较高,在蛙分离株中尤为明显。两种方法测定喹诺酮耐药性结果有一定差异,建议使用稀释法进行药敏测试。

一种新发现的可能病原菌—“香港海鸥型菌”的流行病学研究进展

香港海鸥型菌（Laribacter hongkongensis）是一种新发现可能致人类严重腹泻的病原细菌。该菌2001年首次在香港肝硬化患者的肝和血液中分离到并被鉴定为新种属，后在香港市场出售的近四分之一的淡水鱼的肠道中被分离出来，并被证明与腹泻有关。世界上通常每10至20年才会出现一个全新的细菌属，“香港海鸥型菌”作为一个新发现的细菌属，可能是近20年来发现的首种可致人腹泻、甚至严重胃肠炎的新病菌。

香港海鸥型菌的研究进展

研究人员证实，香港海鸥型菌自被发现以来，即与社区获得性胃肠炎、旅行者腹泻有关，甚至可能是近20年来发现的首种可致严重胃肠炎的新病菌。淡水鱼可能是香港海鸥型菌的主要储存宿主，进食鱼类为其主要的感染途径。同时，亚洲、欧洲、非洲及中美国家相继发现感染个案，提示病菌可能在全球范围广泛分布。本文描述了香港海鸥型菌的生物学及生化特性，并阐述其病原学、流行病学、实验室诊断等方面的主要进展，展望其研究前景。

温度和pH对香港海鸥型菌GRA1株生长的影响

目的研究温度和pH对草鱼肠道中分离的香港海鸥型菌GRA1株生长的影响。方法应用分光光度计测定光密度计算细菌数量，研究香港海鸥型菌GRAI株在不同温度和pH条件下的生长情况。结果香港海鸥型菌GRA1株在〈15℃和〉42℃的条件下不能生长，28℃是该菌比较适宜的生长温度;在pH5．0～9．5范围内可以生长，最适生长pH值范围为5．5～6．0;加热灭活试验表明香港海鸥型菌GRA1株在营养肉汤中65℃15min、90℃5min、100℃1min被灭活，而在用营养肉汤倍比稀释的草鱼糜中65℃20min、90℃8min、100℃6min被灭活。结论试验表明香港海鸥型菌GRA1株为一种嗜温菌．对热和酸的抵抗力均较强。

香港海鸥型菌耐喹诺酮类抗菌药物机制的研究

目的建立香港海鸥型菌生物被膜体外模型,对香港海鸥型菌携带的Ⅰ类整合子相关基因进行分析,探讨香港海鸥型菌耐喹诺酮类抗菌药物的机制。方法吉姆萨染色法形态学角度分析及生结晶紫染色法半定量检测香港海鸥型菌临床分离株生物被膜的形成能力;微量肉汤稀释法测定香港海鸥型菌临床分离株在浮游生长状态与生物被膜状态下对诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星的敏感性;PCR法检测耐喹诺酮类香港海鸥型菌菌株携带的Ⅰ类整合子相关基因。结果吉姆萨染色法定性结果显示,在55株香港海鸥型菌临床分离株中,有36株形成生物被膜,生物被膜形成率为65.4%(36/55);结晶紫染色法半定量检测香港海鸥型菌生物被膜的形成能力,其中8株香港海鸥型菌的吸光度OD560≤0.15,16株香港海鸥型菌的吸光值0.15<OD560≤0.20,7株香港海鸥型菌的OD560>0.20;诺氟沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、环丙沙星、洛美沙星对香港海鸥型菌的最小生物被膜抑菌浓度均高于相应浮游菌的最小抑菌浓度(P<0.05);55株香港海鸥菌中共有18株耐喹诺酮类药物,耐药率32.7%,且18株香港海鸥型菌菌Ⅰ类整合子均含有耐药基因,该耐药基因在相应菌株中发挥耐药作用。结论香港海鸥型菌耐喹诺酮类基因的形成和耐药基因的播散可能与Ⅰ类整合子有关。

广州市香港海鸥型菌红霉素耐药性与基因分析

目的了解广州地区香港海鸥型菌分离株对红霉素的耐药性及红霉素耐药基因的分布情况。方法从青蛙和草鱼肠道中分离的菌株共122株,使用K-B法对香港海鸥型菌分离株进行红霉素抗生素的耐药性测定,用PCR方法检测红霉素耐药株中红霉素抗性基因ereA,ereB,ermA,ermB,ernC,MefA/E,mphA,SAT4的携带情况,并将检测阳性结果的PCR产物进行测序分析。结果香港海鸥型菌对红霉素耐药率为28.7%,其中蛙源株耐药率为35.1%,鱼源株耐药率为25.9%。对红霉素耐药的35株菌中,蛙源株ereA基因检出率为30.8%,鱼源株没有检出ereA基因。结论广州地区香港海鸥型菌对红霉素的耐药率较高,蛙源株对红霉素的耐药率比鱼源株高,海鸥型菌蛙源株对红霉素产生的耐药性与ereA基因相关。

广州市腹泻病人香港海鸥形菌和产肠毒素性大肠杆菌感染情况调查及耐药性检测

目的初步了解广州市腹泻病人中香港海鸥型菌(LH)和产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)感染情况和分离株的耐药情况。方法2008年9月～2009年10月于广州某医院采集了646例门急诊腹泻患者的新鲜粪便标本,用EC肉汤进行增菌,并分别采用麦康凯平板及头孢哌酮麦康凯平板进行ETEC和LH的分离培养;用生物梅里埃API20NE和API20E进行生化鉴定;用PCR方法进行基因鉴定;K-B纸片扩散法作耐药性检测。结果646例标本中未检出LH,检出38例ETEC,检出率6%。药敏结果显示ETEC对头孢类抗生素的敏感性较高,而对青霉素类,四环素类及磺胺类抗生素耐药率较高。结论广州市LH的人群感染率可能较低;ETEC引起的腹泻较10年前有降低倾向,仍需进一步做多中心调查。食用水产品可能是ETEC感染的主要危险因素之一;治疗ETEC类腹泻建议首选头孢类抗生素。

河北省淡水鱼香港海鸥型菌分布及耐药性研究

目的了解河北省淡水鱼中香港海鸥型菌的分布现状及耐药性。方法含头孢哌酮32μg/ml的血平板进行分离,API20NE和VITEK GNI+进行生化鉴定,药敏试验采用K-B琼脂纸片扩散法。结果 429份鱼类样本中,检出8株香港海鸥型菌,总检出率为1.86%(8/429),其中草鱼的检出率为5.43%(5/92),鲤鱼为0.53%(1/189),鲫鱼为2.08%(2/96),其他淡水鱼未检出(0/52)。药敏结果显示8株香港海鸥型菌对万古霉素、头孢哌酮、克林霉素、甲硝唑耐药,对多粘菌素B、替卡西林/克拉维酸、红霉素、庆大霉素、阿米卡星、四环素、环丙沙星、磺胺、氯霉素敏感。结论河北省淡水鱼存在香港海鸥型菌的污染并显示一定程度的耐药,应加强监测和预警,防止香港海鸥型菌病在河北省的流行和传播。

广东省香港海鸥菌感染性腹泻1例分析

目的了解广东省获得性胃肠炎患者中是否存在香港海鸥型菌(LH)感染。方法 2009年4月～12月选择江门市各级医院门诊腹泻患者,采集肛拭子标本,培养分离可疑菌株,经革兰染色、生化鉴定、特异性片段PCR扩增和16S rRNA基因序列测定,进行香港海鸥型菌的鉴定。结果在804例腹泻患者标本中,分离并鉴定1株香港海鸥型菌,符合已有报道菌的菌落特点和生化特征,命名为江门株(JM1),16S rRNA目的基因扩增长度为426 bp,基因序列长度为1 360 bp,与香港分离菌株(NR-025167)同源性为99%,确诊为香港海鸥型菌感染病例。结论证实广东省内社区获得性胃肠炎患者中存在香港海鸥型菌的感染。